phương pháp chuyển gen. Năm 1972, công nghệ ADN tái tổ hợp lần đầu tiên được sử dụng để chuyển gen vào virus SV40, từ đó cho đến nay hàng loạt nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật này ra đời, một trong những ứng dụng quan trọng của công nghệ này là tạo ra được những sinh vật biến đổi gen mang những đặc tính mong muốn. Nhiều giống lúa biến đổi gen cũng được tạo ra nhờ việc áp dụng kết hợp công nghệ ADN tái tổ hợp và các kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật. Có nhiều phương pháp chuyển gen đã được áp dụng ở lúa như sử dụng súng bắn gen, chuyển gen qua tế bào trần hay chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium.
Phương phá p sử dụng súng bắn gen: Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp ADN ngoại lai vào tế bào thực vật, phát triển vào đầu thập niên 1980 bởi các nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell. Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại
nặng có đường kính khoảng 1μm, được bao bọc ADN ngoại lai. Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật, sau khi va chạm callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi đã tiếp nhận các phân tử ADN ngoại lai và tiếp hợp vào hệ gen thực vật. Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, là phương pháp duy nhất có khả năng biến đổi hệ gen ty thể. Tuy nhiên phương pháp này khá tốn kém. Hiên nay hơn 40 giống lúa đã đươc biến nap gen thành công bằng phương pháp này như chuyển thành công gen Xa21 vào giống lúa Indica IR72, làm tăng sức đề kháng của giống lúa này với vi khuẩn gây bệnh bạc lá, chuyển gen cryIA vào các giống KDML105, IR64, Taipei 309 làm tăng khả năng kháng rầy nâu. Các nhà nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu lúa gạo Philippines, đã bắn gen thành công để chuyển đổi hơn 20 giống khác nhau thích nghi với điều kiện sinh thái địa lý khác nhau như psy, crt1, ferritin, FRO2, XA21, Bt, chitinase, enod12, PEPC, glgC, rolC, sd1…(https://plantmethods.biomedcentral.com/).
Phương pháp chuyển gen qua tế bào trần: Ðể ADN dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast. Protoplast có thể được duy trì trong môi trường nuôi cấy như các tế bào sinh trưởng một cách độc lập hoặc với một môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ các tế bào này. Quá trình chuyển gen như thế này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chế vật lý đơn giản mà không cần vector chuyển gen. Ðể nâng cao hiệu quả biến nạp, người ta đã đã xử lý protoplast với PGE (polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện. Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực vật mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện được. Tuy nhiên, việc tạo protoplast cũng như tái sinh cây từ protoplast phức tạp, tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường. Phương pháp được áp dụng thành công cho một số loài phụ Japonica như Nipponbare và Taipei 309.
Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium: được sử dụng phổ biến nhất hiện nay để chuyển gen ở thực vật nói chung và ở lúa nói riêng. Năm 1993, Hiei và cộng sự xây dựng hệ thống chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium cho
hiệu quả cao ở các giống lúa japonica bằng cách sử dụng mô sẹo từ hạt trưởng thành, sau đó trở thành phương pháp chuyển gen phổ biến nhất. Sau đó Salaud và cộng sự đã cải tiến chu trình để rút ngắn thời gian chuyển gen và nâng cao hiệu quả chuyển gen. Các nghiên cứu đánh giá cho thấy chuyển gen gián tiếp thông qua agrobacterium cho sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và di truyền của các gen chuyển ổn định qua nhiều thế hệ (http://www.biotech.iastate.edu/ ).
Agrobacterium tumefaciens là một vi khuẩn tự nhiên phổ biến trong đất và là tác nhân gây bệnh cho một số loài thực vật. Agrobacterium có thể xâm nhập vào thực vật thông qua vết thương ở thân hoặc rễ, chúng gây ra bệnh khối u hình chóp (crown gall) và bệnh lông rễ (hairy root) ở các loài thực vật (http://www.apsnet.org/). Agrobacterium được sử dụng làm trung gian để chuyển gen nhờ khả năng đưa vật liệu di truyền mới vào tế bào thực vật. Vật liệu di truyền được gọi là T-DNA (DNA chuyển) nằm trên một plasmid Ti, là một đoạn DNA tròn được tìm thấy trong hầu hết các vi khuẩn. Trong quá trình chuyển gen, một số thành phần của plasmid Ti cho phép chuyển các gen quan tâm vào tế bào thực vật một cách hiệu quả, bao gồm : 1) vùng trình tự lặp lại ở 2 đầu của T-DNA (left border và right border) phân định đoạn DNA được chuyển vào hệ gen thực vật. Các gen nằm giữa vùng LB và RB không có vai trò trong việc tích hợp T-DNA vào hệ gen thực vật, do đó có thể lợi dụng để thay thế các gen quan tâm và tích hợp vào thực vật; 2) gen vir (gen độc lực), cần thiết để chuyển vùng T-DNA sang cây nhưng bản thân chúng không được chuyển vào; 3) vùng T-DNA được sửa đổi trong đó các gen gây bệnh khối u được loại bỏ và thay thế bằng các gen quan tâm.
T-DNA của Ti-plasmid tự nhiên có thể mang theo một đến hàng chục gen. Ví dụ, T-DNA của pTiC58 có thể mang khoảng 23 kbp. Hiện nay, A.
tumefaciens được báo cáo có thể lây nhiễm tới 643 loài thuộc 331 chi thực vật (https://www.ndsu.edu/pubweb/). Gần đây các nhà khoa học tiến hành cải tiến Ti- plasmid tăng hiệu quả cho quá trình chuyển gen. Có hai hệ thống vector được cải tiến từ Ti-plasmid: vector đồng liên hợp (Cointegrated vector) và vector nhị thể (Binary vector). Hệ thống vector đồng liên hợp là kết quả của sự kết hợp hai vector:
Ti-plasmid đã loại bỏ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine, nhưng
vẫn giữ lại vùng vir và LB, RB; thay vào các đoạn gen bị loại bỏ là đoạn tương đồng với một đoạn DNA trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian). Plasmid trung gian thường là các plasmid tách dòng từ E. coli và có thể tái sinh ở Agrobacterium.
Plasmid này có chứa gen cần chuyển, gen chỉ thị phục vụ việc sàng lọc và đoạn tương đồng Ti-plasmid. Khi hai vector tương tác với nhau, chúng sẽ trao đổi chéo tạo thành vector liên hợp. Do tần số chuyển plasmid từ E. coli sang Agrobacterium rất thấp nên vector này ít được sử dụng. Hệ thống vector nhị thể có hai plasmid: một plasmid tách dòng từ E. coli trong đó thiết kế vùng LB, RB, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển; plasmid thứ hai là Ti-plasmid đã cải tiến chỉ giữ lại vùng Vir (plasmid hỗ trợ). Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium rất hiệu quả.
Quá trình chuyển gen bao gồm các bước sau : 1) phân lập gen quan tâm ; 2) thiết kế cấu trúc chuyển gen mang gen quan tâm, promoter điều khiển biểu hiện gen và gen chỉ thị để hỗ trợ việc sàng lọc cây chuyển gen ; 3) cài gen chuyển vào plasmid Ti ; 4) biến nạp plasmid mang T-DNA vào vi khuẩn Agrobacterium ; 5) đồng nuôi cấy khuẩn với tế bào thực vật để chuyển T-DNA vào hệ gen thực vật ; 6) tái sinh cây chuyển gen ; 7) phân tích cây chuyển gen.
Phân tích cây chuyển gen là một bước rất quan trọng để đánh giá các khía cạnh liên quan đến chức năng của gen quan tâm. Các kỹ thuật sinh học tế bào, sinh học phân tử và sinh lý thực vật được sử dụng như: PCR, Southern blot, giải trình tự DNA, cho phép khẳng định sự có mặt của gen chuyển trong cây, cũng như vị trí của gen cài trong nhiễm sắc thể, số lượng bản sao của gen chuyển trong genome. Mức độ biểu hiện của gen (RNA, protein) được đánh giá bằng các kỹ thuật: Northern blot, qRT-PCR, Western blot, immunofluorescence, ELISA, phân tích kiểu hình.
Các nghiên cứu chuyển gen sử dụng Agrobacterium để tăng cường biểu hiện gen, chuyển các cấu trúc gây bất hoạt gen,... được áp dụng ở hầu hết các phòng nghiên cứu di truyền ở cây lúa với hàng trăm công bố mỗi năm. Năm 2012, các nhà khoa học tăng cường biểu hiện PIN2 ở Nipponbare thông qua việc chuyển gen Agrobacterium dẫn đến chiều cao cây thấp hơn, nhiều nhánh hơn so với loài hoang dại từ đó xác định chức năng của PIN2 trong quá trình phát triển của lúa [4]. Năm
2013, các nhà khoa học tăng cường biểu hiện gen ARG trong lúa Kitaake bằng chuyển gen thông qua Agrobacterium làm tăng số lượng hạt trên bông [28]. Zeng và cộng sự năm 2016 cũng nhận thấy rằng tăng cường biểu hiện GlyI ở Oryza sativa có thể làm tăng tỉ lệ vào chắc của hạt từ đó làm tăng năng suất lúa gạo [47]. Năm 2017, Park và cộng sự chuyển gen ở Kitaake sử dụng Agrobacterium, chứng minh được rằng tăng cường biểu hiện XA21 làm tăng khả năng chống chịu Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) ở Kitaake [35]. Sử dụng phương pháp này mới đây, He và cộng sự (2018) làm tăng cường biểu hiện AFB6 ở lúa, làm tăng đáng kể số lượng hạt/bông, số gié sơ cấp, từ đó làm tăng năng suất lên 50% [13].
1.5 Bất hoạt gen bằng công cụ CRISPR/Cas9 1.5.1. Hệ thống CRISPR/Cas9
Trong những năm gần đây, các kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen, ZFNs (zinc finger nucleases), TALENs (transcription activatorlike effector nucleases) hay CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) đã được phát triển để tạo ra những đột biến tại một vị trí cụ thể trong hệ gen các loài vi sinh vật, thực vật, động vật và cả tế bào người. Trong đó, CRISPR/Cas9 đã trở thành một công cụ mạnh mẽ để chỉnh sửa hệ gen vì có độ đặc hiệu mục tiêu lớn hơn, dễ thiết kế và hiệu quả hơn.
Kỹ thuật CRISPR/Cas9 được phát triển dựa trên hệ thống miễn dịch loại II, CRISPR/Cas9 của vi sinh vật prokaryote trong việc phát hiện và phân hủy DNA của các bacteriophage và plasmid ngoại lai. Để bảo vệ vi khuẩn khỏi DNA ngoại lai, vi khuẩn gắn chèn một đoạn ngắn DNA ngoại lai vào DNA bộ gen tại vùng trình tự lặp lại CRISPR. Vùng trình tự này được phiên mã và được xử lý thành các đoạn RNA ngắn (được gọi là crRNA_CRISPR-derived RNA) có khả năng liên kết với endonuclease Cas để nhận diện DNA mục tiêu (thông qua liên kết bổ sung của trình tự crRNA và DNA mục tiêu) và cắt phân tử DNA mục tiêu thông qua hoạt động endonuclease của Cas (Hình 6). Trong tế bào prokaryote, proteine Cas9 được dẫn dắt đến DNA của gen đích bởi phức hợp 2 RNA không mã hóa CRISPR RNA (crRNA) và trans-activating crRNA (tracrRNA). Sau đó, Jinek và cộng sự đã tổng
hợp thành công một RNA dò duy nhất (sgRNA) hoạt động tương tự như crRNA và tracrRNA [51]. Từ đó hệ thống CRISPR/Cas9 đã được phát triển để trở thành công cụ chỉnh sửa đặc hiệu DNA trong tế bào dựa vào đoạn trình tự RNA dò mà chúng ta đã có thể thiết kế được (http://www.crisprtx.com/).
Chức năng cắt sợi đôi DNA của Cas9 được thực hiện nhờ hai motif cấu trúc:
một vùng RuvC nằm ở đầu amino và một vùng HNH nằm ở vùng giữa trình tự protein. Trong quá trình phá hủy DNA, hai vùng RuvC và HNH cắt phân tử DNA mạch kép tạo ra sự đứt gãy sợi đôi ở trong vùng liên kết bổ sung với gRNA, vùng HNH cắt sợi bổ sung, vùng RuvC cắt sợi không bổ sung. Hoạt tính cắt sợi đôi DNA của Cas9 cũng đòi hỏi một vùng trình tự bảo thủ ngắn (2-5 nucleotides) (protospacer-associated motif (PAM). Cas9 từ Streptococcus pyogenes nhận biết vùng trình tự PAM 5’-NGG-3’ (N là một nucleotide bất kỳ) (Hình 6). Trên thực tế, mặc dù các chuỗi trình tự gRNA bổ sung hoàn toàn mà không có mặt trình tự PAM thì hệ thống Cas9 cũng bỏ qua [51]. Tần suất có mặt của PAM trong genome khá cao nên Cas9/gRNA có thể chỉnh sửa hầu như tất cả các gen. Điểm đứt gãy tạo ra nhờ hoạt động của hệ thống này sẽ được nối lại bởi các cơ chế tự nhiên trong tế bào như tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination HR) hoặc không tương đồng (non-homologous end-joining NHEJ). Quá trình sửa chữa sẽ dẫn đến những thay đổi ngẫu nhiên về trình tự DNA xung quanh điểm đứt gãy như làm mất hoặc thêm một vài nucleotide đối với trường hợp nối không tương đồng (NHEJ), khiến gen bị knock-out. Nếu có 1 đoạn DNA mà trình tự ở 2 đầu của nó tương đồng với điểm đứt gãy thì nó có thể được chèn thêm vào nhờ cơ chế tái tổ hợp (HR) (knock-in gen) [58]. Dựa trên cơ chế này, các nhà khoa học có thể thiết kế gRNA cho các điểm cắt đặc hiệu gây ra đột biến điểm, đột biến mất đoạn hoặc chèn ngang một đoạn trình tự vào đoạn gen có sẵn làm triệt tiêu hoặc thay đổi mức độ biểu hiện của gen đích (Hình 6) [43]. Một ưu điểm nổi bật khi sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 là có thể chọn lọc được các dòng đồng hợp đột biến ngay từ thế hệ T0 chỉ bằng các phản ứng PCR và giải trình tự. Bên cạnh đó còn có thể xác định được các dòng đồng hợp đột biến không mang vector chuyển gen ở thế hệ T1 nhờ vào sự phân ly.
Hình 6. Chỉnh sửa gen với hệ thống CRISPR/Cas9 [43]
Hiện nay, CRISPR/Cas9 được sử dụng phổ biến trong quá trình nghiên cứu chức năng gen thông qua việc knock-out gen. Năm 2013, Shan và cộng sự (2013) sử dụng CRISPR/Cas9 nhắm đích gen PDS (phytoene desaturase) ở lúa, kết quả thu được tần số đột biến mất đoạn lên tới 14,5%–38,0% ở protoplast và 4,0%–9,4%
trong các dòng chuyển gen [38]. Trong khi đó, Xie và Yang (2013) sử dụng CRISPR/Cas9 chỉnh sửa MPK5 ở ba vị trí đích để tăng khả năng kháng bệnh của lúa, và tỉ lệ đột biến của ba vị trí này nằm trong khoảng 3%–8% ở protoplasts của lúa [43]. Thêm vào đó, các nhà khoa học đã chỉ ra rằng các dòng đột biến đồng hợp có thể được tìm thấy ngay từ các cây thế hệ T0 [49]. Nhiều nghiên cứu đã thành công tạo ra các đơn đột biến sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 ở lúa nhằm tạo giống lúa mới năng suất cao. Li và cộng sự (2016) đã ứng dụng thành công công nghệ CRISPR/Cas9 để gây đột biết các gen Gn1a, DEP1, GS3 và IPA1 liên quan đến số hạt/bông, cấu trúc bông, kích thước hạt và cấu trúc của cây lúa. Phân tích cây đột biến T2 cho thấy số lượng hạt tăng lên, bông dựng, hạt to hơn so với cây đối chứng [26]. Gần đây, năm 2018, Butt và cộng sự cũng sử dụng công nghệ CRISPR/Cas9 để gây đột biến gen CCD7 tham gia vào quá trình sinh tổng hợp Strigolactone, một loại hoocmon gây ức chế quá trình đẻ nhánh. Cây lúa đột biến gen ccd7 đẻ nhiều nhánh hơn và có chiều cao thấp hơn cây đối chứng [3].
1.5.2. Chỉnh sửa đa điểm bằng các cấu trúc polycistronic tRNA-gRNA
Đối với các tính trạng nông học phức tạp được quy định bởi nhiều gen như tính trạng năng suất, đặc biệt là cấu trúc bông, việc chỉnh sửa đồng thời nhiều gen là phương pháp hữu hiệu để khám phá cơ chế di truyền của tính trạng. Năm 2014, Kabin Xie và Yinong Yang đã tiến hành nghiên cứu hệ thống tRNA nội bào nhằm mục đích xây dựng hệ thống chỉnh sửa nhiều gen đồng thời. Trong quá trình hình thành tRNA trưởng thành trong tế bào, các RNaseP và RNaseZ sẽ cắt đặc hiệu ở hai đầu 5’ và 3’ một đoạn trình tự không tham gia vào cấu trúc loop/hairpin của tiền tRNA để sản sinh ra tRNA chức năng (Hình 7). Lợi dụng cơ chế này, Xie và cộng sự (2015) đã xây dựng các cấu trúc polycistronic tRNA-gRNA (PTG) chứa các đoạn lặp tRNA-gRNA scaffold để tạo ra đồng thời nhiều gRNA ở lúa. Sau khi các cấu trúc PTG được phiên mã trong tế bào thực vật, hệ thống tRNA-processing RNases nội sinh sẽ nhận biết thành phần tRNA và cắt chính xác để giải phóng các gRNA (Hình 7). Hơn nữa, promoter kiểm soát hoạt động của các gen mã hóa tRNA là một promoter mạnh, có khả năng liên kết với DNA polymerase III, chúng hoạt động ở hầu hết các tế bào và các giai đoạn phát triển khác nhau của tế bào. tRNA là một thành phần cơ bản trong tế bào và việc sản xuất nó được đảm bảo bởi một hệ thống bảo tồn và chính xác. Do đó hệ thống này có thể được sử dụng ở nhiều loài sinh vật khác nhau. Kết quả thử nghiệm cho thấy phương pháp này cho phép bất hoạt đồng thời bốn gen với hiệu suất chỉnh sửa trên cả hai alen từ 57% trở lên [42].
Hệ thống chỉnh sửa nhiều gen PTG cũng đã được áp dụng thành công ở ngô, tạo ra đột biến ở 6 gen khác nhau với tần số xuất hiện các đột biến InDel/SNP lên tới 50-100%. Các nghiên cứu khác ở lúa cho thấy tần số đột biến mất đoạn có thể xảy ra lên tới 35-70% ở protoplasts, tỉ lệ này thấp hơn ở mô sẹo hay cây chuyển gen [42].