3.2.1. Tạo các mảnh thành phần mang cấu trúc gRNA gây bất hoạt ANK1, ANK2
Trong nghiên cứu này, các mảnh thành phần để tạo các cấu trúc gRNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với khuôn là plasmid pGTR và các mồi tương ứng (Bảng 3). Kết quả cho thấy các sản phẩm PCR đều cho sản phẩm phù hợp với tính toán lý thuyết là: 120 bp đối với mảnh P3 và P6 (Hình 19.1-2); 140 bp đối với mảnh P1 và P4 (Hình 19. 3-4); 190 bp đối với mảnh P2, P5 và P7 (Hình 19. 5-6-7).
Các mảnh PCR thành phần được trộn với nhau để tạo cấu trúc gRNA trong phản ứng Golden Gate sử dụng BsaI và T7 DNA ligase.
Hình 19. Kết quả PCR khuếch đại các mảnh thành phần tạo cấu trúc bất hoạt ANK1, ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2.
Thang chuẩn: 8. SiZer™-100 DNA Marker Solution (Intron).1, mảnh P3; 2, mảnh P6; 3, mảnh P1; 4, mảnh P4; 5, mảnh P2; 6, mảnh P5; 7, mảnh P7.
3.2.2. Sàng lọc các cấu trúc PTG
Cấu trúc PTG-ANK1 được sàng lọc bằng cặp mồi ANK1a-F và ANK1b-R cho sản phẩm PCR có kích thước lý thuyết là 200 bp. Cấu trúc PTG-ANK2 được sàng lọc bằng cặp mồi ANK2c-F và ANK2d-R với sản phẩm PCR 200 bp. Cấu trúc PTG-ANK(1+2) được sàng lọc bằng cặp mồi ANK1a-F và ANK2d-R với sản phẩm PCR 550 bp. Kết quả (Hình 20) cho thấy: 6/22 dòng cho kết quả dương tính với cấu trúc PTG-ANK1, 20/22 dòng cho kết quả dương tính với cấu trúc PTG-ANK2, 12/23 dòng cho kết quả dương tính với cấu trúc PTG-ANK(1+2).
Hình 20. Kết quả sàng lọc các dòng E.coli mang cấu trúc PTG bất hoạt ANK1, ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2.
1-24: sàng lọc khuẩn lạc mang cấu trúc PTG-ANK1; 26-49: sàng lọc khuẩn lạc mang cấu trúc PTG-ANK2; 51-75: sàng lọc khuẩn lạc mang cấu trúc PTG-ANK(1+2); 25, 50, 63:
HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen).
Giải trình tự (Bảng 5) cho thấy toàn bộ các cấu trúc đều có ít nhất một dòng plasmid cho kết quả như mong đợi. Các plasmid này được biến nạp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA105 chuẩn bị cho quy trình chuyển gen vào lúa.
Bảng 5. Kết quả giải trình tự các dòng plasmid mang cấu trúc bất hoạt ANK1, ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2
Cấu trúc Số dòng giải trình tự Kết quả giải trình tự
PTG-ANK1 3 3/3 dòng trình tự đúng với thiết kế
PTG-ANK2 3 2/3 dòng trình tự đúng với thiết kế
PTG-ANK(1+2) 5 1/5 dòng trình tự đúng với thiết kế
3.3. Chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Các dòng vi khuẩn Agrobacterium mang các cấu trúc chuyển gen PC5300.OE-ANK1, PC5300.OE-ANK2, Cas9-ANK1, Cas9-ANK2, Cas9-ANK1,2, và hai vector rỗng sử dụng làm đối chứng õm PC5300.OE-ỉ, PDS (7 cấu trỳc) được sử dụng đồng nuôi cấy với mô sẹo Kitaake.
Quy trình chuyển gen được thực hiện qua các bước cơ bản như: tạo mô sẹo, đồng nuôi cấy, sàng lọc, và tái sinh. Hạt lúa Kitaake nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo, sau 3 ngày nuôi cấy có thể quan sát thấy chồi và mô sẹo được tạo ra từ phôi (Hình 21A). Sau 25-28 ngày, xuất hiện các mô sẹo phôi hóa xung quanh phôi.
Chọn các mô sẹo tròn, đồng đều đường kính từ 1-2 mm chuyển sang môi trường tạo mô sẹo mới, nuôi trong 7-10 ngày (Hình 21B). Sau đó các mô sẹo đạt đường kính 4-5 mm, rắn, nhẵn, màu vàng nhạt được lựa chọn để đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn thích hợp. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, các mô sẹo có thể sậm màu hơn, thậm chí một phần mô sẹo có thể bị đen, xung quanh các mô sẹo có thể xuất hiện những chấm khuẩn nhỏ (Hình 21C). Các mô sẹo được sàng lọc trên môi trường bổ sung kháng sinh Hygromycin (50 mg/L), các mô sẹo không nhận được T-DNA sẽ đen dần và chết, các mô sẹo còn sống sót sẽ nhân lên với số lượng lớn và sinh trưởng trên các môi trường này (Hình 21D). Sau 2 tuần trên môi trường chọn lọc, mô sẹo được chuyển sang môi trường tiền tái sinh, rồi môi trường tái sinh để tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Cây hoàn chỉnh được trồng trong môi trường ra rễ (Hình 21F) với
số giờ chiếu sáng 16 giờ/8 giờ: sáng/ tối trước khi được đưa xuống trồng và chăm sóc trong chậu khu vực nhà lưới (Hình 21G).
Hình 21. Hình ảnh chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào giống lúa Kitaake.
A: Hạt lúa Kitaake nuôi 3 ngày trong môi trường tạo mô sẹo, B: mô sẹo 26 ngày tuổi, C:
mô sẹo đồng nuôi cấy với Agrobacterium, D: mô sẹo trên môi trường sàng lọc, E: tái sinh cây từ mô sẹo chuyển gen, F: cây tái sinh trong môi trường tạo rễ. Độ dài tham chiếu:
1cm. G: Cây chuyển gen trồng trong khu vực nhà lưới.
3.4. Chọn lọc các dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 3.4.1. Sàng lọc các dòng T0 chuyển gen, đánh giá hiệu quả chuyển gen
35 dòng tái sinh của mỗi cấu trúc PC5300.OE-ANK1, PC5300.OE-ANK2 và PC5300.OE.ỉ được phõn tớch để sàng lọc cỏc dũng chuyển gen dương tớnh. Cỏc cõy được thu lá, tách chiết DNA để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen HPT (HPT-OE-F và HPT-OE-R, bảng 1). Kích thước mong đợi của đoạn khuếch đại là 999 bp. Kết quả thu được 13 dòng T0.OE-ANK1 dương tính (Hình 22A), hiệu quả chuyển gen đạt 37%, 12 dòng T0.OE-ANK2 dương tính (Hình 22B), đạt hiệu quả chuyển gen 34% và 5 dũng T0.OE.ỉ dương tớnh, hiệu quả chuyển gen chỉ đạt 16%.
Hình 22. Kết quả sàng lọc cây chuyển gen T0 mang cấu trúc tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 bằng PCR.
A: các dòng T0.OE-ANK1, B: các dòng T0.OE-ANK2. (+): vector tăng cường biểu hiện ANK1 (PC5300.OC-ANK1), vector tăng cường biểu hiện ANK2 (PC5300.OC-ANK2). (- )Kitaake không chuyển gen. Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo
Scientific).
3.4.2. Chọn lọc các dòng T1 đồng hợp tử mang một bản sao T-DNA
30 hạt của mỗi dòng chuyển gen T0 được cho nảy mầm trong môi trường MS/2 chứa 50 mg/L Hygromycin. Kết quả thu được 4 dòng tăng cường biểu hiện gen ANK1, 3 dòng tăng cường biểu hiện gen ANK2, 3 dòng mang vector rỗng cho tỷ lệ nảy mầm 3 :1, có khả năng chỉ mang một bản sao T-DNA trong hệ gen.Các dòng này được chuyển ra trồng trong nhà lưới để kiểm tra lại số lượng bản sao T- DNA và chọn lọc cây đồng hợp bằng kỹ thuật qPCR theo phương pháp mô tả bởi Zhang và cộng sự. Số lượng bản sao T-DNA được đánh giá dựa trên tỷ lệ bản sao của gen HPT với gen tham chiếu Sucrose Phosphate Synthase (SPS) (U33175.1) chỉ có 1 bản sao trong hệ gen lúa. Kết quả phân tích 13 dòng T1.OE-ANK1 thu được 3 dòng mang 1 bản sao T-DNA và đồng hợp tử (24.1.3 ; 24.1.4 và 2.7.6), 5 dòng mang 1 bản sao T-DNA nhưng ở thể dị hợp (9.5.1 ; 9.5.2 ; 9.5.5 ; 9.5.12 và 2.7.5), 5 dòng có tỉ lệ 2Ct reference−Cttransgene< 0.5, chưa xác định được số lượng bản sao T-DNA và 1 dũng T1.OE-ỉ đơn bản đồng hợp tử (Bảng 6).
Đối với các dòng T0.OE-ANK2, sức sống của các cây chuyển gen rất yếu.
Phần lớn các dòng T0.OE-ANK2 sau khi được chuyển từ môi trường in vitro ra môi trường ngoài nhà kính có dấu hiệu héo dần và chết, chỉ thu được hạt của 4 dòng (5.3.2; 5.3.3; 5.3.4; 5.3.5). Kết quả đánh giá số lượng bản sao T-DNA các cây T1 chỉ xác định được dòng 5.3.5 mang 1 bản sao T-DNA, đồng hợp tử. Hai dòng 5.3.2, 5.3.4 mang hai bản sao T-DNA trong hệ gen, chưa xác định được kiểu gen, dòng 5.3.3 chưa xác định số bản sao T-DNA (Bảng 7). Số bản sao T-DNA và kiểu gen của ba dòng này sẽ được đánh giá lại ở thế hệ sau.
Bảng 6. Kết quả đánh giá số bản sao T-DNA và kiểu gen của các dòng lúa chuyển gen T1.OE-ANK1
Dòng chuyển gen
T0 Dòng chuyển gen T1 Kết quả qPCR
Số bản sao T-
DNA Kiểu gen
T0.OE-ANK1_17.1
T1.OE-ANK1_17.1.1 0,223 Chưa xác định Chưa xác định T1.OE-ANK1_17.1.2 0,178 Chưa xác định Chưa xác định T1.OE-ANK1_17.1.3 0,231 Chưa xác định Chưa xác định T1.OE-ANK1_17.1.5 0,179 Chưa xác định Chưa xác định
T0.OE-ANK1_24.1
T1.OE-ANK1_24.1.3 1,170 1 Đồng hợp
T1.OE-ANK1_24.1.4 1,069 1 Đồng hợp
T0.OE-ANK1_9.5
T1.OE-ANK1_9.5.1 0,575 1 Dị hợp
T1.OE-ANK1_9.5.2 0,698 1 Dị hợp
T1.OE-ANK1_9.5.5 0,487 1 Dị hợp
T1.OE-ANK1_9.5.12 0,416 1 Dị hợp
T1.OE-ANK1_9.5.13 0,131 Chưa xác định Chưa xác định
T0.OE-ANK1_2.7
T1.OE-ANK1_2.7.5 0,519 1 Dị hợp
T1.OE-ANK1_2.7.6 1,289 1 Đồng hợp
T0.OE-ỉ_27.0 T1.OE-ỉ_27.0.2 0,964 1 Đồng hợp
Bảng 7. Kết quả đánh giá số bản sao T-DNA và kiểu gen của các dòng lúa chuyển gen T1.OE-ANK
Dòng chuyển gen
T0 Dòng chuyển gen T1 Kết quả qPCR
Số bản sao T-
DNA Kiểu gen
T0.OE-ANK2_5.3
T1.OE-ANK2_5.3.2 2,352 2 Chưa xác định T1.OE-ANK2_5.3.3 0,177 Chưa xác định Chưa xác định T1.OE-ANK2_5.3.4 2,032 2 Chưa xác định
T1.OE-ANK2_5.3.5 1,130 1 Đồng hợp
3.4.3. Đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK1, ANK2 trong các dòng chuyển gen
Mức độ biểu hiện của gen ANK1 và ANK2 được đánh giá trong các dòng chuyển gen chỉ mang 1 bản sao T-DNA ở thể đồng hợp và thể dị hợp bằng qRT- PCR. Mồi CDS-ANK1-F, CDS-ANK1-R và CDS-ANK2-F, CDS-ANK2-R (Bảng 1) được thiết kế trong vùng trình tự mã hóa của 2 gen, sử dụng gen tham chiếu ACTIN để tính mức độ biểu hiện tương đối của gen ANK.
Phân tích kết quả qRT-PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen ANK1 cho thấy mức độ biểu hiện của gen đều được tăng lên trong các dòng chuyển gen T1. Mức độ biểu hiện của gen ANK1 được chia thành 3 nhóm với mức độ biểu hiện khác nhau.
Nhóm thứ nhất gồm hai dòng T1.OE-ANK1_2.7.5 và T1.OE-ANK1_2.7.6 có nguồn gốc từ mô sẹo chuyển gen số 2, với mức độ biểu hiện lần lượt tăng 7 và 15 lần so với cõy Kitaake khụng chuyển gen và cõy đối chứng õm T1.OE-ỉ_27.0.2.
Trong đó dòng T1.OE-ANK1_2.7.6 đã được xác định là đồng hợp tử, còn dòng T1.OE-ANK1_2.7.5 ở thể dị hợp. Nhóm thứ hai gồm 2 dòng đồng hợp T1.OE- ANK1_24.1.3 và T1.OE-ANK1_24.1.4 có nguồn gốc từ mô sẹo chuyển gen số 24, mức độ biểu hiện của gen ANK1 tăng lần lượt 5400 và 5300 lần so với đối chứng.
Nhóm thứ ba gồm 5 dòng được tái sinh từ mô sẹo chuyển gen số 9, có mức độ biểu hiện của gen ANK1 tăng từ 1000-1500 lần so với các dòng đối chứng, cả 5 dòng này
đều ở thể dị hợp tử. Biểu hiện của gen ANK1 giữa các cây đối chứng âm 27.0.2 và cây Kitaake không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (Hình 23).
Hình 23. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK1 trong các dòng chuyển gen
Với số lượng cây ít, sức sống kém, số hạt thu được từ các cây chuyển gen không nhiều, việc nghiên cứu ANK2 gặp nhiều khó khăn. Kết quả phân tích biểu hiện của gen ANK2 trong ba dòng T1.OE-ANK2_5.3.2; T1.OE-ANK2_5.3.4;
T1.OE-ANK2_5.3.5 chỉ tăng từ 2-3 lần so với đối chứng (Hình 24).
Lê Thị Như – K26CH
52
Hình 24. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK2 trong các dòng chuyển gen
3.5. Chọn lọc các dòng chuyển gen đột biến gen ANK1, ANK2 bằng công