3.5.1. Sàng lọc các dòng chuyển gen T0 mang cấu trúc chuyển gen
Phân tích cây chuyển gen T0 bằng các phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen HPT nhằm khuếch đại 1 đoạn DNA có kích thước mong đợi 571 bp. Kết quả thu được 10 dòng mang cấu trúc Cas9-ANK1, 15 dòng mang cấu trúc Cas9- ANK2, 7 dòng mang cấu trúc có khả năng gây đột biến cả hai gen ANK1 và ANK2 (Cas9-ANK(1+2)) và 2 dòng mang cấu trúc rỗng không chứa PTG (PDS) (Hình 25)..
Hình 25. Sàng lọc các dòng chuyển gen T0 bằng PCR Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
Kết quả này đã được kiểm tra bằng một phản ứng PCR khác sử dụng cặp mồi pUBI-F và Cas9-R, nhằm khuếch đại một vùng trình tự mã hóa protein Cas9, kết quả nhận được cho kết luận tương tự.
3.5.2. Sàng lọc các dòng chuyển gen T0 đột biến gen ANK1, ANK2
Để sàng lọc đột biến, phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi được thiết kế nằm ở hai đầu của hai gRNA sử dụng cho mỗi gen. Đột biến (deletion) có thể quan sát được trên gel agarose nếu xuất hiện băng DNA thấp hơn so với ở cây đối chứng không mang cấu trúc chuyển gen.
Kết quả điện di sản phẩm PCR của các cây T0 mang cấu trúc Cas9-ANK1 cho thấy có sự xuất hiện của băng DNA thứ 2 thấp hơn so với băng DNA đặc hiệu ở cây đối chứng Kitaake (382 bp), như ở cây T0.Cas9-ANK1_1.8; T0.Cas9- ANK1_2.32 và T0.Cas9-ANK1_5.1, tuy nhiờn khoảng cỏch giữa 2 băng khụng rừ ràng (Hình 36A). Kết quả giải trình tự cho thấy cây T0.Cas9-ANK1_1.8 dị hợp tử,
Lê Thị Như – K26CH
54
mỗi alen mất lần lượt 2 bp và 3 bp ở exon 4 của gen ANK1, cây T0.Cas9- ANK1_2.32 đồng hợp tử mất 1bp so với đối chứng, và cây T0.Cas9-ANK1_5.1 cũng có kiểu gen dị hợp tử trong đó 1 alen không bị đột biến và 1 alen mất 13 bp (Bảng 8).
Hình 26. Sàng lọc đột biến bằng PCR
A : các dòng T0.Cas9-ANK1, B : các dòng T0.Cas9-ANK2 ; C : các dòng T0.
Cas9- ANK(1+2). Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
Đối với các dòng Cas9-ANK2, phân tích kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 26B) và giải trình tự cho thấy trong số 15 dòng dương tính có 3 dòng mang đột biến mất đoạn từ 59-78 bp trong vùng exon 4 và là đột biến dị hợp (Bảng 8).
Đối với các dòng chuyển gen với cấu trúc Cas9-ANK(1+2), 2 phản ứng PCR được thực hiện để sàng lọc đột biến với 2 cặp mồi sử dụng trong sàng lọc các cấu trúc đơn. Từ hình ảnh điện di có thể thấy bốn dòng (22.61 và 60.12; 60.23; 60.27) có băng DNA với kích thước khác biệt so với đối chứng (Hình 26C). Hai dòng 22.61 và 60.12 đã được giải trình tự, nhưng không phân tích được kết quả do hình ảnh bị nhiễu. Các dòng này sẽ được phân tích và giải trình tự lại ở thế hệ tiếp theo.
Bảng 8. Kết quả phân tích đột biến các gen ANK1, ANK2 ở các cây chuyển gen thế hệ T0
Dòng chuyển gen T0 Kiểu gen
T0.Cas9-ANK1_1.8 Dị hợp (-2 bp/-3 bp) T0.Cas9-ANK1_2.32 Đồng hợp (-1 bp/-1 bp)
T0.Cas9-ANK1_5.1 Dị hợp (-13 bp/WT) T0.Cas9-ANK2_2.1 Dị hợp (-60 bp/-59 bp) T0.Cas9-ANK2_4.131 Dị hợp (-59 bp/WT) T0.Cas9-ANK2_5.10 Dị hợp (-59 bp/-78 bp) T0.Cas9-ANK(1+2)_22.61
Chưa xác định T0.Cas9-ANK(1+2)_60.12
T0.Cas9-ANK(1+2)_60.23 T0.Cas9-ANK(1+2)_60.27
WT: wild-type, không mang đột biến.
3.5.3. Chọn lọc các dòng T1 đột biến đồng hợp
Các dòng chuyển gen thế hệ T0 mang đột biến hầu hết đều tồn tại ở trạng thái dị hợp tử (trừ dòng T0.Cas9-ANK1_2.32), các dòng này tiếp tục được phân tích ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự như ở thế hệ T0 để tìm kiếm các dòng đột biến đồng hợp tử.
Đối với gen ANK1, thu được bốn dòng T1 đột biến đồng hợp tử (ank1-1.8.4, ank1-2.32.12, ank1-5.1.3, ank1-5.1.8) mất từ 1 bp đến 8 bp (Hình 27A). Phân tích cấu trúc protein của các thể đột biến cho thấy 3 dòng ank1-5.1.3, ank1-5.1.8, ank1-2.32.12 xuất hiện mã kết thúc sớm ở sau axit amin thứ 127, 126, 125 (Hình 27B). Protein mới của cả 3 thể đột biến đều mất 4 motif ankyrin cuối cùng so với protein của thể không đột biến, chỉ còn lại 2 motif ankyrin đầu tiên trong cấu trúc và do đó mất vị trí liên kết
với các phân tử peptide khác. Đối với dòng ank1-1.8.4 (mất 3 bp trong trình tự DNA, mất axit amin thứ 125 trong trình tự protein) protein mới tạo ra vẫn bảo tồn 6 motif ankyrin như protein không bị đột biến (Hình 27C).
Hình 27. Sự thay đổi trong trình tự DNA (A), trình tự protein (B) và cấu trúc protein (C) của các dòng đột biến T1.Cas9-ANK1
Đối với gen ANK2, kết quả phân tích chỉ ra có ba dòng đột biến đồng hợp tử , mất 50-70 bp trong trình tự DNA. Dòng đột biến ank2-2.1.8 mất 60 bp trong DNA, loại bỏ 20 axit amin trong trình tự protien, tuy nhiên số lượng các motif ANK và TPR trong protein không bị thay đổi so với protein không đột biến. Dòng ank2-
5.10.1 mất 59 bp, tạo mã kết thúc sớm trong chuỗi mã hóa protein. Protein đột biến mất 2 motif ankyrin sau cùng và 3 motif TPR, không thể tạo ra vị trí bám với các peptide khác. Dòng đột biến ank2-5.10.6 mất 78bp trong trình tự mã hóa, dẫn đến thiếu hụt 26 axit amin trong trình tự chuỗi polypeptide, làm mất đi motif ankyin số 4. Sự vắng mặt của motif ankyrin số 4 làm tăng khoảng cách giữa motif số 3 và số 5, do đó có khả năng cấu trúc không gian của phân tử protein này không thể hình thành vị trí liên kết với các phân tử sinh học khác (Hình 28).
Lê Thị Như – K26CH
57
Hình 28. Sự thay đổi trong trình tự DNA(A), trình tự protein (B) và cấu trúc protein của các dòng đột biến T1.Cas9-ANK2
Đối với hai dòng chuyển gen mang cấu trúc có khả năng gây đột biến đồng thời cả hai gen ANK1, ANK2 (22.61.1 và 60.21.1), kết quả phân tích trình tự của cả hai gen cho thấy dòng 60.21.1 không có đột biến ở cả hai gen ANK1, ANK2. Trong khi đó dòng ank12-22.61.1 có đột biến đồng hợp ở cả hai gen, mất 4 bp ở exon 4 của gen ANK1 và mất 20 bp ở exon 4 của gen ANK2. Cả hai đột biến này tạo ra hai protein xuất hiện mã kết thúc sớm. Protein ANK1 chỉ còn 2 motif ankyrin đầu tiên, protein ANK2 mất 2 motif ankyrin cuối cùng và cả 3 motif TPR. Cả hai protein đều mất vị trí liên kết với các phân tử sinh học khác (Hình 29).
Các dòng đột biến tạo protein không hoàn chỉnh được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 29. Sự thay đổi trong trình tự DNA, trình tự protein và cấu trúc protein của dòng đột biến T1.Cas9-ANK(1+2)
Lê Thị Như – K26CH
59 KẾT LUẬN Đề tài đã thu được các kết quả như sau:
1. Đã phân lập, nhân dòng và giải trình tự đẩy đủ 2 gen ANK1, ANK2
2. Thiết kế được cấu trúc vector tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 dưới sự kiểm soát của promoter Ubiquitin và chuyển thành công vào giống lúa Kitaake.
3. Thiết kế thành công các cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) để bất hoạt riêng rẽ hoặc đồng thời hai gen ANK1, ANK2 bằng công nghệ CRISPR/Cas9 và chuyển thành công vào giống lúa Kitaake.
4. Chọn lọc được ba dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1 đồng hợp tử, mang một bảo sao T-DNA, trong đó biểu hiện của gen ANK1 tăng 6-5400 lần so với các dòng đối chứng. Tuy nhiên chỉ chọn được 1 dòng tăng cường biểu hiện gen ANK2 với mức độ biểu hiện tăng hơn 2 lần so với đối chứng.
5. Chọn lọc được 4 dòng đột biến gen ANK1 đồng hợp, ba trong số đó tạo protein không hoàn chỉnh và mất vị trí liên kết với phối tử. Đồng thời thu được 3 dòng đột biến gen ANK2 đồng hợp, trong đó 2 dòng tạo ra protein không hoàn chỉnh và mất vị trí tương tác với protein. Chỉ chọn được duy nhất 1 dòng đồng hợp đột biến cả 2 gen ANK1, ANK2, cả 2 protein đột biến đều mất vị trí liên kết với protein khác.
KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả thu được của đề tài, chúng tôi sẽ tiến hành đánh giá kiểu hình cấu trúc bông của các dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 và các dòng đột biến để làm sáng tỏ vai trò của gen ANK1, ANK2 liên quan đến cấu trúc bông, đặc biệt là 2 tính trạng số gié thứ cấp/bông và số hoa/bông.
Bên cạnh đó, biểu hiện của gen ANK1, ANK2 trong các mô phân sinh cấu trúc bông sẽ được nghiên cứu bằng phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) ở các dòng chuyển gen và dòng đối chứng. Tương tác của protein ANK1, ANK2 với các phối tử được dự đoán trên cơ sở phân tích tin sinh cũng sẽ được kiểm định bằng phương pháp lai miễn dịch để từ đó hiểu sâu hơn về các cơ chế hoạt động của protein ANK1, ANK2.
Phần lớn các SNPs, Indels được tìm thấy trong vùng promoter của 2 gen ANK1, ANK2 nên các nghiên cứu phân tích chức năng promoter của 2 gen cũng sẽ được tiến hành.