Môi trường:
Môi trường tổng hợp bổ sung 2% NaCl : TSA (Tryptic Soy Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), BA (Blood Agar) có bổ sung 5% máu cừu.
Môi trường Nutrient Broth ở các nồng độ muối khác nhau: 0 ppt, 10 ppt, 30 ppt, 40 ppt, 50 ppt để kiểm tra khả năng chịu mặn của vi khuẩn.
Môi trường O/F để kiểm tra khả năng lên men và oxi hóa của vi khuẩn
Môi trường KIA (Klinger Iron Agar) để kiểm tra khả năng sinh hơi, sinh H2S và khả năng lên men glucose, lactose của vi khuẩn.
Môi trường Manitol để kiểm tra khả năng di động và lên men đường manitol của vi khuẩn.
Test API Strep để thử đặc điểm sinh hóa của các chủng liên cầu khuẩn.
Hóa chất:
Thuốc nhuộm gram: Crystal Violet, Lugol, cồn Acetone và Fushin
Thuốc thử kèm theo API Strep test kit H2O2 để thử phản ứng Catalase
Giấy tẩm hóa chất Tetramethyl Phenylenediamine Edihydroclorid để thử phản ứng Oxidase
7 loại kháng sinh để thử kháng sinh đồ gồm: NA (Nalidixic Acid), NOR (Norfloxacin), E (Erythromycine), GM (Gentamycine), AMX (Amoxyciline), CN (Celfalexin), DO (Docyxyline)
Nước muối sinh lý, dầu soi kính, cồn tuyệt đối.
2.2 Dụng cụ, thiết bị
Phân lập, định danh vi khuẩn :
Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy, nồi áp suất, bếp điện, kính hiển vi Giá đựng ống nghiệm
Hộp lồng, ống nghiệm
Que cấy đầu tròn, đầu nhọn, que cấy chan Pipette, micropipette, đầu côn
Đèn cồn, lam, lamen
Bông không thấm nước, etiket Một số dụng cụ khác : xô, chậu…
Xác định độc lực:
6 thùng nhựa, thể tích 100 L, thuốc gây mê, sục khí 60 con cá bớp giống cỡ 26-28 g, 16-17cm
Vợt vớt cá, thùng xốp để gây mê cá
Kim tiêm cỡ 1ml. Và một số dụng cụ khác 3. Phương pháp nghiên cứu
Trong nghiên cứu này ngoài việc kiểm tra KST, tôi chỉ lựa chọn tập trung vào các cầu khuẩn có dạng chuỗi để nghiên cứu mà không phân tích tất cả các chủng vi
khuẩn thu được từ cá bệnh . Tuy nhiên việc lựa chọn liên cầu khuẩn để nghiên cứu là có căn cứ, sẽ được trình bài ở phần “kết quả nghiên cứu”.
Tìm hiểu về bệnh mù mắt ở cá bớp (Rachycentron canadum) nuôi lồng tại Khánh Hòa
Mô tả các dấu hiệu bệnh lý chính bên ngoài và bên trong
của cá bị bệnh mù mắt
Nghiên cứu phát hiện tác nhân gây bệnh
Kiểm tra KST làm tiêu bản để phân loại
Kết luận về tác nhân gây bệnh mù mắt ở cá bớp nuôi lồng tại Khánh Hòa Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Kiểm tra, phân tích các chủng liên cầu khuẩn
Làm tiêu bản phết nhuộm
gram
Phân lập vk từ mắt, não, gan, thận.
Định danh vk
Thử độ nhạy kháng
sinh Làm tiêu
bản mô bệnh học
Cảm nhiễm ngược, xác định LD50
3.1 Phương pháp thu mẫu
Thực hiện phương pháp thu mẫu chọn lọc, thu 20 con cá bệnh có dấu hiệu đục mắt(có hoặc không kèm theo xuất huyết ở mắt), màu sắc đen tối, cá bơi lờ đờ gần thành lồng. Cá được vận chuyển sống hoặc bảo quản lạnh khô (đối với những nơi không đóng được túi Oxy) về phòng thí nghiệm để phân tích. Đồng thời thu 4 con khỏe từ những lồng không bị bệnh làm mẫu đối chứng.
3.2 Phương pháp nghiên cứu kí sinh trùng
Áp dụng phương pháp nghiên cứu kí sinh trùng toàn diện trên cá của Dogiel 1929 có sữa chữa bổ sung cho phù hợp với điều kiện khí hậu ở Việt Nam bởi Hà Ký 1993 và Bùi Quang Tề 2002. Trong nghiên cứu này chỉ thực hiện nghiên cứu kí sinh trùng ở da, mắt, mang, gan và thận.
3.3 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn
Áp dụng phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn đang lưu hành tại các phòng thí nghiệm nghiên cứu về bệnh ở động vật thủy sản của Việt Nam
Vi khuẩn được phân lập từ gan, thận, mắt và não của cá bệnh và cá khỏe trên các loại môi trường TSA, KF. Sau đó đem ủ ở 28oC trong 24-48h. trước khi phân lập vi khuẩn, mô đích (mắt, gan, thận, não) được sát trùng bằng cồn 70o để tránh tạp nhiễm
Chọn chủng vi khuẩn nghi ngờ dựa vào vi khuẩn ưu thế trong tiêu bản mắt, não, gan, thận phết nhuộm gram và vi khuẩn ưu thế trên đĩa thạch.
Kiểm tra đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn bằng, API Strep kit và kết hợp kiểm tra bổ sung một số đặc điểm sinh hóa bằng phương pháp truyền thống: KIA, Manitol di động, catalase, oxidase, khả năng chịu đựng nồng độ muối.
Phân loại vi khuẩn dựa vào khóa phân loại của của Bergey kết hợp so sánh đối chiếu một số kết quả của các nghiên cứu trước.
Nuôi cấy phân lập trên các loại môi trường (TSA,
KF)
Phết mô mắt, não, gan và thận
nhuộm gram Mẫu bệnh phẩm
(mắt, não, gan, thận)
Kiểm tra đặc điểm hình thái, gram của các chủng vi khuẩn mọc trên đĩa thạch phân lập. Chọn khuẩn lạc để nuôi cấy thuần chủng dựa vào vi khuẩn ưu thế trên đĩa thạch và vi khuẩn ưu thế trong tiêu bản mô phết. Nuôi cây thuần chủng và
lưu giữ chúng trên môi trường TSA
Kiểm tra đặc điểm gram, hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào vi khuẩn, khả năng chịu
mặn của vi khuẩn
Kiểm tra đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn bằng API kit, kết hợp
với một số phản ứng sinh hóa bằng phương pháp truyền thống
Hình 2.2 Sơ đồ khối phương pháp nghiên cứu vi khuẩn từ cá bệnh
Định danh vi khuẩn dựa vào hệ thông phân loại của Bergey và các nghiên cứu trước
3.3 Phương pháp mô bệnh học:
Áp dụng phương pháp mô bệnh học truyền thống được mô tả trong tài liệu “Một số phương pháp nghiên cứu và chẩn đoán bệnh ở động vật thủy sản” của Đỗ Thị Hòa 2005 (Tài liệu lưu hành nội bộ).
3.4 Phương pháp làm tiêu bản mô phết và nhuộm gram
Dùng bông thấm cồn 70o sát trùng các mô đích (gan, thận, mắt, não). Dùng kéo cắt một ít mô đích, dùng kẹp phết nhẹ lên lam sạch, để khô tự nhiên sau đó nhuộm gram theo phương pháp của Christin Gram 1884.
Mẫu cá bệnh và mẫu đối chứng
-Đọc tiêu bản trên kính hiển vi quang học
-So sánh biến đổi mô học mẫu bệnh và mẫu đối chứng
Gắn tiêu bản bằng bomcana -da
Nhuộm mẫu bằng H&E
Cắt mẫu bằng máy Microton Làm mất
nước và làm mềm mẫu
Thấm parafin và đúc mẫu Cố định trong
Bouin và giữ trong cồn 70o
Hình 2.3 Sơ đồ quy trình nghiên cứu mô bệnh học
3.5 Thí nghiệm cảm nhiễm ngược bằng vi khuẩn Steptococcus iniae
Cá bớp khỏe mạnh cỡ 16-17cm được tuyển chọn nuôi thuần 10 ngày trước khi làm thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành trong thùng nhựa 100 lít, có sục khí
Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức (NT) : 10 con/NT được nuôi trong thể tích 70 lít nước: 1 NT đối chứng , 5 NT được tiêm chủng vi khuẩn Streptococcus iniae với 5 nồng độ khác nhau: 3,35x104 tb/cá, 3,35x105 tb/cá, 3,35x106 tb/cá, 3,35x107 tb/cá và 3,35x108 tb/cá. Vi khuẩn được pha theo thang độ đục Mcfarland và được cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm vào xoang bụng của cá bớp khỏe. NT đối chứng tiêm nước muối sinh lý 0,85 ppt.
Nguồn nước thí nghiệm được bơm từ biển, lọc qua bể lọc cơ học và xử lý bằng chlorine 15ppm, sục khí mạnh 4 ngày trước khi dùng cho thí nghiệm
pH, nhiệt độ đo 2 lần/ngày vào lúc 8h và 14h
Cho ăn 2 lần/ngày bằng thức ăn nổi theo nhu cầu của cá Nhuộm mẫu
bằng dung dịch Crystal Violet
Cố định mẫu bằng dung dịch Lugol
Tẩy màu bằng cồn Aceton Rửa
mẫu qua nước
Rửa mẫu qua nước
Rửa mẫu qua nước Nhuộm mẫu
bằng dung dịch Safranin Rửa
mẫu qua nước
Hình 2.4 Sơ đồ quy trình nhuộm gram
Hình 2.5 Sơ đồ thí nghiệm cảm nhiễm ngược Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae
cho cá bớp khỏe ( cỡ 16cm)
NT Đ/C Tiêm dung dịch PBS 0,15ml/cá
NT1 Tiêm Vk 3,35x104
tb/cá
NT2 Tiêm Vk 3,35x105
tb/cá
NT4 Tiêm Vk 3,35x107
tb/cá NT3
Tiêm Vk 3,35x106
tb/cá
NT5 Tiêm Vk 3,35x108
tb/cá
Theo dừi sự xuất hiện bệnh tớch của cỏc đàn cỏ thớ nghiệm ghi chép số liệu và thu mẫu để phân tích
Mô tả hoạt động bất thường, dấu hiệu bên ngoài và bên trong của cá bệnh
Làm tiêu bản mô bệnh học các mô gan,
thận, não, mắt Phân lập
,phết nhuộm gram vi khuẩn từ cá bệnh, định danh vi khuẩn
Kết luận về khả năng gây bệnh của vi khuẩn lên các bớp thí nghiệm
Nuôi thuần dưỡng cá trong 10 ngày
Cảm nhiễm với vi khuẩn S.iniae
Theo dừi hoạt động của cỏ, mụ tả dấu hiệu bệnh lý bờn trong và bờn ngoài của cá chết, ghi chép số liệu theo ngày.
Tất cả cá chết hoặc hấp hối được bảo quản lạnh khô và được chuyển về phòng thí nghiệm để phân lập vi khuẩn và làm tiêu bản mô bệnh học (chọn 5 con cá xuất hiện dấu hiệu bệnh đặc trưng đang hấp hối để nghiên cứu mô bệnh học và 2 con cá khỏe để làm mẫu đối chứng).
3.6 Phương pháp làm kháng sinh đồ
Phương pháp đĩa kháng sinh được sử dụng để thử độ nhạy của các loại kháng sinh khác nhau đối với vi khuẩn gây bệnh. 7 loại đĩa kháng sinh được sử dụng gồm NA (Nalidixic Acid), NOR (Norfloxacin), E (Erythromycine), GM (Gentamycine), AMX (Amoxyciline), CN (Celfalexin), DO (Docyxyline).
Pha dịch huyền phù của vi khuẩn bằng nước muôi sinh lý để tạo ra huyền dịch với độ đục tiêu chuẩn McFarland 0,5 (1,5x108 tb/ml). 0,1 ml dịch huyền phù vi khuẩn được chan đều trên bề mặt thạch TSA, để 5-10 phút cho khô mặt thạch rồi nhẹ nhàng đặt các đĩa kháng sinh lên mặt thạch. Ủ các đĩa thạch này ở 28oC trong 48 giờ, đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước chia vạch có vạch chính xác 1mm
3.7 Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để xử lý số liệu Dùng phần mềm SPSS để tính LD50
PHẦN 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Dấu hiệu bệnh lý của cá bớp nuôi lồng tại Khánh Hòa khi bị mù mắt
Dấu hiệu bên ngoài
Số cá có dấu hiệu/số mẫu
Dấu hiệu bên trong Số cá có dấu hiệu/số mẫu Màu da đen tối
Mòn vây
Xuất huyết trên da Đục mắt
Lồi mắt
Xuất huyết mắt
7/20 2/20 5/20 20/20 11/20 5/20
Thận sưng Lách sưng Gan xuất huyết Gan nhợt nhạt Ruột rỗng,tích dịch Bóng hơi teo
13/20 3/20 8/20 2/20 3/20 2/20
Bảng 3.1 Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong của cá bớp bị bệnh mù mắt 1.1 Dấu hiệu bên ngoài
100% mẫu cá bệnh thể hiện dấu hiệu bệnh lý đặc trưng là mắt bị tổn thương(n=20):
đục 1 hoặc 2 bên mắt, mắt đục có thể lồi hoặc không, mắt đục có kèm theo xuất huyết hoặc không.
Ngoài ra còn có những dấu hiệu không đặc trưng như: màu da đen tối (7/20 mẫu), vây xơ rách(2/20 mẫu), xuất huyết nhẹ ở miệng, gốc vây, nắp mang.
Những con cá bị mù cả 2 mắt có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội không định hướng gần thành lồng, cá phản ứng chậm với tác động, ăn ít hoặc không ăn.
1.2 Dấu hiệu bên trong
Dấu hiệu thường thấy trong nội quan cá bệnh là hiện tượng sưng to ở thận phần đuôi thận(13/20) và xuất huyết ở gan (8/20)
Một số mẫu có dấu hiệu như lách sưng to, gan nhợt nhạt, ruột rỗng và tích dịch Ngoài ra còn một số dấu hiệu khác mà rất ít mẫu có như: lách chai cứng, xuất huyết thành xoang bụng,bóng hơi teo
Có 3/20 mẫu cá bệnh không thể hiện dấu hiệu bệnh lý bên trong