3.9.1. Chiết bằng trao đổi ion
Dịch lọc cho chạy qua cột trao đổi ion với nhựa cationid Amberlite IRC50 (dạng Na+), phản hấp phụ bằng dung dịch HCl0,75M, tốc độ chảy chung của các dịch qua cột là 4,5ml/phút.Thu lấy dịch ở các phân đoạn khác nhau điều chỉnh về pH7, đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch với VSV kiểm định là P.mirabilis. Kết quả không tách được kháng sinh bằng sử dụng cột trao đổi ion.
3.9.2.Chiết bằng dung môi hữu cơ
Tiến hành chiết kháng sinh 1 lần bằng các dung môi khác nhau trên các pH khác nhau: 3, 7, 10 với tỷ lệ Vdm ÷ Vdịch lọc = 1÷ 5. Đánh giá hoạt tính kháng sinh của pha dung mơi hữu cơ (dmhc) bằng phương pháp khoanh giấy lọc, pha dịch lọc (N) bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả được trình bày ở bảng 11 và hình 8.
Bảng 11: Kết quả chiết xuất kháng sinh bằng dung môi khác nhau ở các pH khác nhau.
Kếtquả
PH Tham số
Hoạt lực kháng sinh trên Bacillus pumilus
Cloroform Butyl acetat Diclomethan n-Butanol
N dmhc N dmhc N dmhc N dmhc 3 D (mm) 25,71 20,57 22,19 20,06 26,36 23,54 8,26 22,89 s 1,02 0,20 1,24 0,72 1,97 0,73 7,25 1,47 7 D (mm) 25,52 21,34 3,55 24,11 26,73 24,15 16,59 27,34 s 1,56 0,81 6,14 0,58 0,54 0,19 1,39 1,29 10 D (mm) 24,36 22,72 0,00 25,12 26,72 24,94 0,00 24,66 s 0,68 0,56 0,00 1,45 0,50 0,49 0,00 1,32
Nhận xét: Cả hai dung môi Butyl acetat và n-Butanol chiết được hết
kháng sinh từ dịch lọc ở pH10. Chọn n-Butanol để nghiên cứu tiếp.
Hình 8 : Ảnh chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 3.10.KẾT QUẢ SẮC KÝ LỚP MỎNG
Sau khi chiết kháng sinh từ dịch lên men sang n-Butanol ta tiến hành sắc ký lớp mỏng để xác định thành phần kháng sinh và làm cơ sở cho việc tinh chế sau này. Kết quả sắc ký được giới thiệu ở bảng 12 và hình 9 . Vi khuẩn kiểm định là Proteus mirabilis. Bảng 12: Kết quả sắc ký lớp mỏng Kết quả Hệ dung môi Rf UV VSV Thuốc thử
Hệ 1 0,87 0,87 -
Hệ 2 0,89 0,89 -
Hệ 3 0-0,81 0-0,81 -
Hệ dung môi chạy sắc ký:
-Hệ 1: Clorofoc: Metanol: amonihytroxyd(25%) (2:2:1) -Hệ 2: n-Butanol: Etanol: dimetylformamid (3:1:1) -Hệ 3: Butylaxetat: axeton: trietylamin (1:2:1) Không phát hiện được bằng thuốc thử hóa học (-)
Nhận xét: Kháng sinh phát hiện được bằng ánh sáng tử ngoại nhưng
không phát hiện được bằng một số loại thuốc thử hóa học (như Ninhydrin 1% trong cồn 96o).
-Sơ bộ kết luận trong dịch lọc của Streptomyces 40.16 có ít nhất 2 thành phần kháng sinh (một thành phần có hoạt tính mạnh và một thành phần có hoạt tính yếu hơn).
Hình 9 : Sắc ký lớp mỏng dịch kháng sinh 3.11. KẾT QUẢ THỬ ĐỘ BỀN CỦA KHÁNG SINH
Dịch lọc kháng sinh đem đun sôi ở 1000C, đun sôi 1000C trong 30 phút và đun cách thủy 30 phút. Lấy dịch lọc đem thử hoạt tính bằng phương pháp giếng thạch, kết quả ở bảng 13.
Bảng 13: Kết quả bền nhiệt của kháng sinh VSV
kiểm định
Độ bền nhiệt của kháng sinh
1000C Sôi 30 phút Cách thủy B.pumilus D (mm) s D (mm) s D (mm) s 24,44 0,61 27,04 0,24 24,41 0,20 P.mirabili s D (mm) s D (mm) s D (mm) s 20,78 0,35 22,98 0,31 20,49 0,42
Nhận xét: Kháng sinh do chủng Streptomyces 40.16 tổng hợp rất bền với
nhiệt, có thể thuận lợi khi nghiên cứu tinh chế kháng sinh với quy mô lớn hơn.