2.1.NGUYÊN LIỆU
2.1.1.Giống vi sinh vật
*Chủng xạ khuẩn:
Giống xạ khuẩn Streptomyces 40.16 phân lập và tuyển chọn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, phổ tác dụng rộng, đặc tính di truyền ổn định, do phịng thí nghiệm Vi sinh Kháng sinh bộ mơn Vi sinh và Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
*Chủng vi sinh vật kiểm định:
Giống VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh và sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp:
-Vi khuẩn Gram (-):
Escherichia coli ATCC 25922 (E.coli) Proteus mirabilis BV 108 (P.mirabilis)
Shigella flexneri DT 112 (S. flexneri) Salmonella typhi DT220 (S.typhi)
Pseudomonas aeruginosa VM 201 (P.aeruginosa)
-Vi khuẩn Gram (+):
Staphylococcus aureus ATCC1128 (S.aureus)
Bacillus pumilus subtilis ATCC 10241 (B.pumilus) Bacillus subtilis ATCC 6633 (B.subtilis)
Bacillus creus ATCC 9946 (B.creus) Sarcina lutea ATCC 9341 (S.lutea)
2.1.2.Các môi trường nuôi cấy
*Môi trường phân lập:
Chủng xạ khuẩn 40.16 được phân lập trên môi trường 1 (MT1): Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch 1,8g; Nước vừa đủ 100ml.
*Môi trường nuôi cấy và khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh: +Môi trường 1 (MT1): Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch 1,8g; Nước vừa đủ 100ml; pH=6,8-7,2.
+Môi trường 2 (MT2): Tinh bột 2g; KCl 0,05g; NaNO3 0,2g; K2HPO4 0,1g; MgSO4,7H2O 0,01g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml.
+Môi trường3 (MT3): Lactoza 3g; CaCO3 0,4g; K2HPO4 0,5g; NH4NO3 0,2g; MgSO4,7H2O 0,01g; Na2SO4 0,05g; Cao ngô 0,5g; Thạch 1,8g; pH=7,0- 7,2; Nước vừa đủ 100ml.
+Môi trường 4 (MT4): Glucoza 2g; Cao ngô 0,5g; NH4NO3 0,2g; CaCO3 0,4g; K2HPO4 0,5g; MgSO4,7H2O 0,15g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml.
+Môi trường 5 (MT5): Bột đậu tương 1g; Cao thịt 2g; CaCO3 0,2g; (NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml.
+Môi trường 6 (MT6): Bột ngô 2g; CaCO3 0,2g; NaCl 0,1g; CoCl2,H2O 0,002g; K2HPO4 0,05g; Bột đậu tương 1,5g; Cao nấm men 0,5g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml.
+Môi trường 7 (MT7): Sacaroza 3g; Bột đậu tương 1g; CaCO3 0,2g; CoCl2,H2O 0,002g; (NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml.
*Môi trường lên men là các mơi trường trên ở dạng dung dịch (khơng có thạch), ví dụ MT1dd: Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Nước vừa đủ 100ml
*Các môi trường sử dụng nuôi cấy VSV kiểm định
Các môi trường sử dụng nuôi cấy VSV kiểm định được giới thiệu tại bảng sau:
Bảng các môi trường kiểm định
Thành phần Môi trường NaCl (%) Cao thịt (%) Pepton (%) Glucoza (%) Thạch (%) pH Canh thang 0,5 0,3 0,5 - - Thạch thường 0,5 0,3 0,5 - 1,8 7,0-7,4 Sabouraud lỏng 1 2 - Sabouraud đặc 1 2 1,8 6,0-6,5
*Các môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trường ISP1 đến ISP9):
Dung dịch muối vi lượng của ISP: FeSO4,7H2O 0,01g; MnCl2,4 H2O 0,1g; ZnSO4, 7H2O 0,1g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH=7,0-7,2.
-ISP1: Tryptone 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,2 trước khử trùng.
-ISP2: Cao nấm men 40g; dịch chiết Malt 10,0g; glucoza 4,0g; nước cất 1000ml; pH=7,3; Thạch 20g.
-ISP3: Bột yến mạch 20,0g; thạch 18,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4.
IPS4: Tinh bột 10,0g; K2HPO4 1,0g; MgSO4,7H2O 1,0g; NaCl 1,0g;
(NH4)2SO4 2,0g; CaCO3 2,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP5: L-asparagin 1,0g; glyxerin 10,0g; K2HPO4 1,0g; dung dịch muối vi
lượng 1,0ml; thạch 20g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4.dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP6:
+ Dung dịch A: Pepton 20g; sắt amoni xitrat 0,5g; Na2S2O3 0,08g; K2HPO4 1,0g; nước cất vừa đủ 1000ml.
+ISP6: dung dịch A 36,0g, cao nấm men 1,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; thạch 15g; pH=7,0-7,2.
ISP7: Glycerin 15,0g; L-Tyrosin 0,5g; L- asparagin 1,0g; K2HPO4 0,5g.
MgSO4, 7H2O 0,5g; NaCl 0,5g; FeSO4,7H2O 0,01g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4.
ISP9:
+ Các nguồn đường đã tiệt trùng (A):
1: Glucoza 4: Arabinoza 7: D-Fructoza 2: Sacaroza 5: Inositol 8: Rhamnoza 3: D-Xyloza 6: D-mannitol 9: Rafinoza
+ Dung dịch muối Pridham và Gottlieb (B) CuSO4,5H2O 0,69g; FeSO4,7 H2O 0,15g, nước cất 1000ml.
+ Mơi trường thạch – muối khống (MTC): (NH4)2SO4 0,69g; K2HPO4 2,38g; MgSO4, 7H2O 1,0g; dung dịch B 1,00ml; thạch 15,0g; nước cất 1000ml; pH=6,8-7,0
+ D*ISP9: MTC sau khi đã tiệt trùng để nguội tới 600C thì cho một trong các nguồn đường A vào từng MTC riêng rẽ sao cho nồng độ đường trong môi trường là 1%.