2 1.1 Đối tượng
2.1.4 Một số công thức sử dụng tính toán thống kê
n
- Giá trị trung bình: X = —n ^/=1
- Độ lệch chuẩn tương đối RSD; RSD (%) = ¿ .100
X
- t s
- Khoảng tin cậy; X ±
2.2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện sắc ký
Dựa trên kết quả nghiên cứu của khoá luận tốt nghiệp dược sỹ đại học 2004 của sinh viên Lê Thanh Tùng về nghiên cứu định lượng artesunat nguyên liệu bằng HPLC:
Điều kiện sắc ký:
o Pha động: Acetonitril: MeOH: Đệm phosphat pH3,5 (10: 50 : 40) o Cột: Nucleosil C18 (250x4 mm; 5|xm). o Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. o Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng, o Detector: u v = 216 nm. o Thể tích tiêm: 20|Lil(dung dịch 4mg/ml)
Kết quả tách và định lượng được artesunat với thời gian lưu của 3 pic như sau: Pic acid succinic tỵ= 2,673 phút
Pic artesunat ír= 7,220 phút Pic DHA tR= 27,540 phút
Từ kết quả trên ta thấy DHA lưu giữ quá lâu, vì vậy khi xác định DHA sẽ rất tốn kém thòi gian, tiền bạc, mặt khác 3 pic trên tách nhau khá xa nên chúng tôi tìm cách thay đổi điều kiện pha động để thời gian lưu của DHA ngắn lại và vẫn đảm bảo tách được 3 pic. Từ phân tích lý thuyết và thực nghiệm chúng tôi nhận thấy: A.succinic rất phân cực nên bị lưu giữ ngắn và ít phụ thuộc vào tỉ lệ pha động. DHA không phụ thuộc pH nhưng rất khó tan trong nước và đễ tan trong MeOH; vì vậy thòi gian lưu của DHA sẽ phụ thuộc
rất nhiều vào tỉ lệ MeOH, MeOH càng nhiều thì thời gian lưu của DHA càng ngắn lại. Thời gian lưu của artesunat phụ thuộc pH, tuy nhiên dưới dạng muối kim loại kiềm artesunat tan trong nước nhiều hơn DHA. Qua khảo sát chúng tôi thấy rằng ở pH = 7,1 thì 3 pic trên tách tốt nhất Từ phân tích trên chúng tôi đã tiến hành khảo sát với hệ pha động gồm: MeOH: Đệm phosphat pH7,l với tỉ lệ MeOH tăng dần như sau:
1. MeOH: Đệm pH7,l (62:38) 2. MeOH: Đệm pH7,l (65:35) 3. MeOH: Đệm pH7,l (68:32) 4. MeOH: Đệm pH7,l (70:30)
Kết quả thấy rằng hệ 4: MeOH: Đệm phosphat pH7,l (70:30) đảm bảo vừa đủ việc tách a. succinic , artesunat, DHA và rút ngắn thời gian lưu của DHA nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký để nghiên cứu xác định DHA trong nguyên liệu artesunat như sau:
Cột: Nucleosil C18 (250x4 mm; 5|.im).
Pha động: MeOH: Đệm phosphat pH7,l (70:30)
Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút. Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng. Thể tích tiêm: 20 ỊLil (dung dịch 4mg/ml).
Trên cơ sở quy định của Dược Điển VN: Giới hạn DHA< 1%, vì vậy chúng tồi sẽ khảo sát DHA ở mức 1% so với nguyên liệu (nồng độ làm việc Ở100% của DHA là 0,04 mg/ml) (từ đây khi nói nồng độ % của DHA có nghĩa là % so với nguyên liệu).
2.2.2 Thử tính thích hợp của hệ thống
Các pic dùng trong định lượng phải đảm bảo được một số yêu cầu thì mới sử dụng trong phân tích để đảm bảo chính xác cho kết quả, vì vậy cần phải đánh giá tính thích hợp của hệ thống.
Tiến hành: Tiến hành sắc ký 5 mẫu artesunat chuẩn (nồng độ 4 mg/ml) có thêm 1% DHA để đánh giá các thông số.
Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống.
stt Pic artesunat Pic DHA
Hệ số bất đối Diện tích Hệ số bất đối Diện tích
1 1,10 85,620 1,06 0,684 2 1,09 85,630 1,07 0,682 3 1,12 85,650 1,08 0,680 4 1,10 85,600 1,07 0,681 5 1,08 85,630 1,06 0,681 độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,0182 % RSD = 0,0152 %
Như vậy các giá trị của hệ số bất đối (As) đều nằm trong khoảng: 0,9- 2,0 và R SD <2%
Như vậy hệ thống thích hợp để định lượng artesunat và DHA. Hình 1: sắc ký đồ thử tính thích hợp của hệ thống.
!/ựựL2lSlY.i
2.0 ~~T~ '“77^Sjữ '—8£<t— IOjQ i2ữ ìiữ ' I 'iéù 2ũữ
2.2.3 Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp xác định DHA trongartesunat nguyên liệu artesunat nguyên liệu
Khảo sát từ khoảng nồng độ DHA từ 0,2% đến 2% so với nồng độ nguyên liệu 4 mg/ml nghĩa là (0,008mg/ml- 0,08mg/ml).
Tiến hành: Pha 5 mức nồng độ như sau; 0,8^2% (0,008mg/ml), 0,18^5% (0,02mg/ml), 1% (0,04mg/ml), 1,5% (0,06mg/ml), 2% (0,08mg/ml).
Mỗi nồng độ tiến hành sắc ký 3 lần theo quy trình rồi lấy kết quả trung bình.
Bảng 2: Kết quả khảo sát tuyến tính DHA.
Nồng độ
(mg/ml) 0,008 0,02 0,04 0,06 0,08
Diện tích
(mAu.min) 0,141 0,344 0,682 0,999 1,377
Từ kết quả ta có đồ thị phương trình hồi quy tuyến tính của DHA: Đồ thị 1: Đồ thị phương trình tuyến tính của DHA.
Hệ số tương quan: r = 0,9996 (r > 0,99).
Y_intercep = 0,001 (= 0,006% so với giá trị ồ 100%). Độ lệch chuẩn của y_intercep: Sb = 0,0135.
Khoảng tin cậy của y_intercep: 0,001 +/- 0,0192 (chứa 0).
Vì vậy có sự phụ thuộc tuyến tính cao giữa nồng độ và đáp ứng ở khoảng khảo sát: 0,2% - 2% DHA so với nguyên liệu.
2.2.4 Tính chính xác của phưoTig pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệu
Xác định ờ nồng độ làm việc của DHA 100% là 0,04mg/ml (1% so với nguyên liệu).
Tiến hành: Pha 6 mẫu thử DHA ở nồng độ 1% so với nguyên liệu, đồng thời làm mẫu chuẩn DHA tương đương, rồi sắc ký theo quy trình, lấy kết quả.
Cách pha: Cân lượng DHA chính xác khoảng 10,0 (mg) rồi pha trong bình định mức 50 (ml) được dung dịch 0,2 mg/ml, lấy chính xác 10 ml dung dịch trên pha loãng trong bình định mức 50 ml được dung dịch 0,04 mg/ml (1%).
Bảng 3: Kết quả khảo sát tính chính xác. Tt Khối lượng chuẩn(mg) Diện tích (mAu.min) Khối lượng Thử (mg) Diện tích (mAu.min) Hàm lượng(%) 1 10,0 0,681 9,9 0,678 100,56 2 10,0 0,681 10,0 0,680 99,85 3 10,0 0,681 10,1 0,684 99,45 4 10,0 0,681 10,1 0,681 99,01 5 10,0 0,681 10,1 0,681 99,01 6 10,0 0,681 10,2 0,684 98,47 Hàm lượng trung bình c = 99.39 % . Độ lệch chuẩn SD = 0,737.
Độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,742 % (< 2%). Khoảng tin cậy của hàm lượng: 99.39 ± 0,774.
10.1
Vậy phương pháp xác định DHA là chính xác.
Hình 2: sắc ký đồ của một mẫu thửDHA.
m antiaí # 1 rm o d ifle d bv A d m in istra to rl M an u al A c q u is itio n UV_VIS_.1 WVL: 216 nm mAU 8.S^ 7.5 €.3’ 5 .a 3.Ô 2-S: 1.3 0.0 -2.q: 2 - 13.32 min 0.0 '..'....’...r - 5.0 15.0 20.0 25,0 3(
No. Ret.Time Peak Name Heigh Area Rel.Area Amou
Type
Min mAU mAU*min %
1 13.32
BMB*
n a 0.411 0.684 100.00 na
Total: 0.938 1.118 100.00 0.000
2.2.5 Tính đúng của phương pháp xác định DHA trong nguyên liệu artesunat
Nguyên tắc: Vì nguyên liệu artesunat chưa xác định rõ hàm lượng DHA nên xác định tính đúng phải theo phương pháp thêm ở 3 mức nồng độ theo dãy nồng độ khảo sát là: 0,2% (0,008mg/ml), 1% (0,04mg/ml), 1,5% (0,06mg/ml) (từ kết quả khảo sát nguyên liêu có hàm lượng DHA khoảng 0,3 %)
-Tiến hành:
• Pha dung dịch chuẩn DHA:
Cân chính xác khoảng 25,0 (mg) DHA chuẩn cho vào bình định mức 50 (ml) hoà tan và thêm dung môi đến vạch được dung dịch (1) (0,5mg/ml) lấy chính xác 5ml dung dịch (1) pha loãng thành 25 ml trong bình định mức 25 ml được
dung dịch (2) ( 0,lmg/ml)
• Pha dung dịch nguyên liệu artesunat 4m g/m l:
Cân chính xác khoảng 0,1000(g) nguyên liệu artesunat pha trong bình định mức 25 ml, làm 5 mẫu, tiến hành sắc ký xác định DHA trong nguyên liệu • Dung dịch artesunat nguyên liệu thêm 0,2% chuẩn DHA.
tiến hành pha dung dịch artesunat nguyên liệu như trên nhưng thêm chính xác 2,00 ml dung dịch (2) rồi thêm dung môi đủ 25 ml, làm 3 mẫu tiến hành sắc ký lấy kết quả trung bình.
• Dung dịch artesunat nguyên liệu thêm 1% chuẩn DHA.
Làm như trên nhưng thêm 10,00 ml dung dịch (2) rồi thêm dung môi đủ 25 ml, làm3 mẫu, tiến hành sắc ký lấy kết quả trung bình.
• Dung dịch artesunat nguyên liệu thêm 1,5 % chuẩn DHA.
Làm như trên nhimg thêm 15,00 ml dung dịch (2) rồi bổ xung dung môi đủ 25 ml, làm 3 mẫu lấy kết quả trung bình.
Dung môi pha các dung dịch là MeOH : Nước (70 : 30).
Các kết qủa trình bày ở bảng 4. Bảng 4: Kết quả khảo sát tính đúng.
Nồng độ thêm Lượng thêm (mg) Lượng thu hồi (mg)
% tìm lại Khoảng tin cậy (%)
0,2% 0,200 0,198 99,0 99,0 ±0,4
1 % 1,00 0,996 99,6 99,6 ± 0,2
Vậy phần trăm thu hồi luôn nằm trong khoảng: 98% - 102%
Phưoỉng trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất thêm vào và lưcmg thu hồi của hoạt chất: y = l,001x - 0,003
Đồ thị 2: Đồ thị đánh giá tính đúng của phương pháp.
Độ lệch chuẩn “residual”: s = 0,00262 Độ lệch chuẩn của a: Sa = 0,00283
Độ lệch chuẩn của y_ intercep: Sb = 0,00296 Khoảng tin cậy của độ dốc: 1,001 ± 0,031 (chứa 1)
Khoảng tin cậy của y_ intercep; - 0,003 ± 0,038 (chứa 0) Vậy không có sai số hệ thống
Không có sai số hằng định Phương pháp là đúng.
2.2.6 Tính đặc hiệu của phưotig pháp xác định DHA trong artesunat nguyên liệu
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn DHA và ghi sắc ký đồ. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn DHA:
Hình 3; sắc ký đồ của mẫu chuẩn DHA
Từ sắc ký đồ trên ta thấy chỉ có 1 pic của DHA tại thời gian lưu là: Ir = 13,753 phút
- Sắc ký mẫu trắng (MeOH: H2O (70:30)), ghi sắc ký đồ. Hình 4: sắc ký đồ của mẫu trắng.
QQ LAM #8 fmodified by AdministratorỊ trang uv VIS 1
:ìiAU 0.75- 0.50- 0.25- -0.75- -1.00- 11.00 11.50 12.007Ỉ~ 12.507 T 13.00 13.50 WVL;216nm 7 7 14.50 min 14.93
Từ sắc ký đồ của mẫu trắng ta thấy không có pic lạ nào ở thòi gian lưu của DHA
- Tiến hành sắc ký dung dịch artesunat nguyên liệu 4mg/ml có thêm DHA và acid succinic. Ta có kết quả sắc ký đồ:
Ret.Tim Amou Rel.Are Resoluti
No. Peakname e Area nt Type Height a on
min mAU*min mAU %
1 n.a. 2.847 1.5812 n.a. BMB 3.371 6.54 2.03
2 n.a. 4.42 21.4772 n.a. BMB 40.483 88.83 6.5
3 n.a. 13.327 1.1208 n.a. BMB* 0.924 4.64 n.a.
Total: 24.1791 0 44.777 100
Hình 5: sắc ký đồ đánh giá độ phân giải.
45.( 40.0-
30.0-
20.0-
10.0-
LAM #1 [modified by Administrator] mAU LAM -5.0 UV_VIS_1 WVL:216nm 2 - 4.420 3 -1 3 .3 2 7 T“ 2.0 4;0 6.0 s!o 1Ò.0 12.0 14.0 16.0 18.0
Kết quả ở bảng 5: Độ phân giải của acid succinic, DH A, artesunat.
min
0.0 19.9
Chất Thời gian lưu tR(min) Độ phân giải Rs
Acid succinic 2,847
artesunat 4,420 2,03
Như vậy acid succinic và artesunat có độ phân giải Rs = 2,03 hai pic coi như tách nhau hoàn toàn
artesunat và DHA có độ phân giải Rs = 6,50 hai pic tách hoàn toàn
Vậy phưcíng pháp định lượng aitesunat và xác định DHA trong nguyên liệu xây dựng ở đây có tính đặc hiệu cao
2.2.7 Xác định giói hạn định lượng DHA theo phương pháp xây dựng
Giới hạn định lượng là nồng độ thấp nhất của DHA mà ta có thể định lượng đảm bảo tính đúng và tính chính xác theo phương pháp xây dựng.
Cách xác định:
- Theo ước tính giới hạn định lượng DHA ở khoảng 0,05% so với nguyên liệu nồng độ 4mg/ml.
- Vì vậy tiến hành xác định đáp ứng của DHA ỏ’ 5 nồng độ liền kề đó là: 0,05% (0,002mg/ml), 0,1% (0,004mg/ml), 0,2% (0,008mg/ml), 0,3% (0,012mg/ml), 0,4% (0,016mg/ml).
Bảng 6: Kết quả khảo sát ở 5 nồng độ gần giới hạn định lượng
Nồng độ
(%) 0,05 0,10 0,20 0.30 0,40
Diện tích
(mAu.min) 0,060 0,102 0,135 0,206 0,272
Phương trình đường chuẩn:
Y = 0,586x + 0,032(1) (r = 0,992)
X là nồng độ chuẩn DHA
ở nồng độ thấp nhất 0,05%: xác định 5 kết quả và tính độ lệch chuẩn(SD).
Bảng 7: Kết quả xác định đáp ứng của DHA ở nồng độ 0.05 %
1 0,0589 s,b= 0,0606
2 0,0604 SD = 0,0027
3 0,0610
4 0,0650
5 0,0580
Ta có phương trình tín hiệu của giới hạn phát hiện là: Y = 3SD + b=3SD + 0,032 (2)
Từ (1) và (2) ta có cách tính nồng độ giới hạn phát hiện(Xj(,d):
3SD+0,032 = 0,586x,„d + 0,032 => x,^= 380/0,586
Vậy giới hạn định lượng (Xioq) là:
Xjoq= lO.Xiod/3 = 0,0463 % hay 1,85 |ig/m l
2.2.8 Xây dựng cách xác định DHA trong nguyên liệu artessunat khi không có DHA chuẩn
Trong kiểm nghiệm thuốc để thuận tiện cho việc xác định tạp chất
thường người ta không sử dụng chất chuẩn tạp mà lấy đáp ứng pic tạp nhân
với hệ số biến đổi để tính ra hàm lượng phần trăm của tạp.
Do hàm lượng artesunat và DHA trong mẫu thử không ổn định vì vậy chúng tôi tiến hành xác định hệ số biến đổi F dựa vào khoảng thay đổi nồng độ của các chất này.
- Xác định khoảng tuyến tính của artesunat nguyên liệu.
Tiến hành xác định khoảng tuyến tính của artesunat nguyên liệu trong khoảng 80 % - 120 % nồng độ làm việc 4 mg/ml (3,2 mg/ml - 4,8 mg/ml) theo phương pháp xây dựng.
Bảng 8: Kết quả khảo sát tuyến tính của artesunat.
Nồng độ
(mg/ml) 3,2 3,6 4,0 4,4 4,8
Diện tích
(mAU.min) 68,36 77,03 85.63 94,81 102,69
Hình 6: sắc ký đồ của artesunat chuẩn ở nồng độ 110% so với nồng độ làm việc:
No. Peakname Ret.Time Area Amount Type Height Rel. Area Resolution
min mAU*min mAU %
1 n.a. 3.207 0.239 n.a. BMB* 0.374 0.25 1.15
2 n.a. 4.473 94.091 n.a. BMB* 146.73 99.6 5.17
3 n.a. 12.653 0.143 n.a. BMB* 0.111 0.15 n.a.
Phương trình hồi quy: y = 21,60x-0,74 Hệ số tương quan: r = 0,9995
Y_intercep: - 0,74
Độ lệch chuẩn y_intercep: Sb = 1,049
Khoảng tin cậy y_intercep - 0,74 ± 1,049 (chứa 0)
Vậy phương pháp là tuyến tính trong khoảng 3,2 mg/ml artesunat nguyên liệu.
- Tính tuyến tính của DHA đã xác định ở mục 2.3 Nếu F là hệ số đáp ứng của DHA ta có:
p _ ^ A rt -^DH A 4,8 mg/ml ^ D H A Art Khi S^,.J — Sqha thì: p z= 21,60.c^^^ 0,74 _ J cArt 17,003 .C ™ +0,001 21,60 0,741 ^ c , , 17,003 17,003.c,,
Vì trong khoảng khảo sát là: 3,2 - 4,8 => F = 1,27 - = 1,27-(0,014/0,009)
Có.thể lấy kết quả gần đúng của hệ số đáp là: F = 1,26
Từ tính toán trên ta có công thức tính hàm lượng DHA như sau: C _ Z7 ^DHA n ^DHA
DHA - ^ -
^An ^Art
2.2.9 Kết luận
Qua các kết quả nghiên cứu khảo sát trên, chúng tôi đưa ra phương pháp xác định hàm lượng DHA khi tiến hành định lượng artesunat nguyên liệu như sau: • Điều kiện sắc ký lỏng hiệu năng cao:
- Cột: nucleosil C18(250x4mm; 5|.im) hoặc tương đương.
- Pha động: MeOH: Đệm phosphat pH7.1 (70:30) (cách pha đệm phosphat; l,36g KH2P04trong lOOOml nước, điều chỉnh về pH 7.1 bằng KOH 10 %). Tốc độ dòng: 0.6 ml/phút
- Detector : u v = 216 nm.
- Thể tích tiêm : 20 (|Lil).
- Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng.
- Dung dịch thử: Có chứa chính xác khoảng 4mg/ml artesunat nguyên liệu.
- Dung dịch chuẩn: Có chứa chính xác khoảng 4mg/ml artesunat chuẩn(vkn) và 0.04mg/ml DHA chuẩn (nếu có)
Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử ghi kết quả, các kết quả chỉ được lấy khi hệ thống đảm bảo tính thích hợp (N > 3000, Rs > 1,5; 0,9 < As < 2). Làm 5 mẫu, lấy kết quả trung bình với điều kiện độ lệch chuẩn của các kết quả < 2%
«/oARTESUNAT = -P
^ A rtc h ^
Trong đó :
• SArtthu là diện tích pic dung dịch thử (lĩiAU. min) • S^rtch là diện tích pic dung dịch chuẩn (mAU. min) • m là khối lượng nguyên liệu cân (mg)
• V là độ pha loãng của dung dịch thử (ml) • C^rtch là nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml) • p là hàm lượng chuẩn (98,6%)
Tính hàm lượng DHA trong nguyên liệu:
Trường hợp có chuẩn: %DHA/nguyên liệu = -^MnL £ . —.100
^DHAch ^
Trong đó:
- Sj5HAni SjjHAch là diện tích pic của DHA trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng (mAU.min)
- m là khối lượng nguyên liệu cân (mg) - V là độ pha loãng của dung dịch thử (ml) - Cj5HAch là nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml)