2 1.1 Đối tượng
2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện sắc k ý
Dựa trên kết quả nghiên cứu của khoá luận tốt nghiệp dược sỹ đại học 2004 của sinh viên Lê Thanh Tùng về nghiên cứu định lượng artesunat nguyên liệu bằng HPLC:
Điều kiện sắc ký:
o Pha động: Acetonitril: MeOH: Đệm phosphat pH3,5 (10: 50 : 40) o Cột: Nucleosil C18 (250x4 mm; 5|xm). o Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. o Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng, o Detector: u v = 216 nm. o Thể tích tiêm: 20|Lil(dung dịch 4mg/ml)
Kết quả tách và định lượng được artesunat với thời gian lưu của 3 pic như sau: Pic acid succinic tỵ= 2,673 phút
Pic artesunat ír= 7,220 phút Pic DHA tR= 27,540 phút
Từ kết quả trên ta thấy DHA lưu giữ quá lâu, vì vậy khi xác định DHA sẽ rất tốn kém thòi gian, tiền bạc, mặt khác 3 pic trên tách nhau khá xa nên chúng tôi tìm cách thay đổi điều kiện pha động để thời gian lưu của DHA ngắn lại và vẫn đảm bảo tách được 3 pic. Từ phân tích lý thuyết và thực nghiệm chúng tôi nhận thấy: A.succinic rất phân cực nên bị lưu giữ ngắn và ít phụ thuộc vào tỉ lệ pha động. DHA không phụ thuộc pH nhưng rất khó tan trong nước và đễ tan trong MeOH; vì vậy thòi gian lưu của DHA sẽ phụ thuộc
rất nhiều vào tỉ lệ MeOH, MeOH càng nhiều thì thời gian lưu của DHA càng ngắn lại. Thời gian lưu của artesunat phụ thuộc pH, tuy nhiên dưới dạng muối kim loại kiềm artesunat tan trong nước nhiều hơn DHA. Qua khảo sát chúng tôi thấy rằng ở pH = 7,1 thì 3 pic trên tách tốt nhất Từ phân tích trên chúng tôi đã tiến hành khảo sát với hệ pha động gồm: MeOH: Đệm phosphat pH7,l với tỉ lệ MeOH tăng dần như sau:
1. MeOH: Đệm pH7,l (62:38) 2. MeOH: Đệm pH7,l (65:35) 3. MeOH: Đệm pH7,l (68:32) 4. MeOH: Đệm pH7,l (70:30)
Kết quả thấy rằng hệ 4: MeOH: Đệm phosphat pH7,l (70:30) đảm bảo vừa đủ việc tách a. succinic , artesunat, DHA và rút ngắn thời gian lưu của DHA nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn điều kiện sắc ký để nghiên cứu xác định DHA trong nguyên liệu artesunat như sau:
Cột: Nucleosil C18 (250x4 mm; 5|.im).
Pha động: MeOH: Đệm phosphat pH7,l (70:30)
Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút. Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng. Thể tích tiêm: 20 ỊLil (dung dịch 4mg/ml).
Trên cơ sở quy định của Dược Điển VN: Giới hạn DHA< 1%, vì vậy chúng tồi sẽ khảo sát DHA ở mức 1% so với nguyên liệu (nồng độ làm việc Ở100% của DHA là 0,04 mg/ml) (từ đây khi nói nồng độ % của DHA có nghĩa là % so với nguyên liệu).