Các giai đoạn Nhiệt độ (0
C) Thời gian (giây) Số chu kỳ
Biến tính ban đầu 96 60 1
Biến tính 96 10
25
Gắn mồi 50 5
Kéo dài 60 240
2.3.8.6. Tinh sạch sản phẩm giải trình tự
Sản phẩm của phản ứng xác định trình tự được tinh sạch bằng phương pháp cột sephadex theo hướng dẫn của nhà sản xuất theo qui trình sau:
- Cho cột sephadex vào ống thu dịch ly tâm 2 ml và ly tâm 3.000 vòng/phút trong 2 phút.
- Chuyển cột sephadex sang ống eppendorf 1,5 ml.
- Chuyển tồn bộ dung dịch của phản ứng giải trình tự của mỗi mẫu vào một cột sephadex và ly tâm 3.000 vòng/phút trong 2 phút.
- Bỏ cột sephadex. Sấy khô dung dịch của phản ứng giải trình tự trong ống eppendorf bằng máy ly tâm chân khơng tại 1.500 vịng/phút trong 10 phút ở 450
C. - Sản phẩm sau tinh sạch được gửi tới phịng Trọng điểm Cơng nghệ gen- Viện Công nghệ sinh học để đọc kết quả trên máy phân tích trình tự tự động ABI 3100 Avant Genetic Analyzer.
2.3.8.7. Phân tích trình tự và lập cây phát sinh chủng loại
- Sử dụng chương trình BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng đã được các tác giả khác công bố trên ngân hàng gen (Genbank).
- Sử dụng phần mềm MEGA 4.0 để phân tích khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo các phương pháp Maximum Parsimony (MP), Minimum Evolution (ME).
Chƣơng III
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khả năng gây chết BSL của tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3
3.1.1. Gây nhiễm ấu trùng BSL
Ấu trùng cảm nhiễm (IJs) của tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3 phân lập từ Tam Đảo– Vĩnh Phúc được gây nhiễm cho ấu trùng BSL với mật độ 50-60 IJs/sâu. Kết quả cho thấy, sau 24h thì sâu bắt đầu chết, xác ấu trùng BSL sẽ có màu vàng nâu, khơng có mùi thối và mềm nhưng dai khi gắp bằng kẹp và tỷ lệ chết là 100% sau 48h.
Hình 3.1. Ấu trùng BSL chết do nhiễm Steinernema sp. TĐ3 (bên trái); và nhiễm Heterorhabditis sp. TĐ17 (bên phải).
Tiến hành phân lập vi khuẩn cộng sinh từ xoang máu của ấu trùng vật chủ và thu ấu trùng cảm nhiễm (IJs) bằng phương pháp Whitetrap nhằm lưu giữ nguồn tuyến trùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Thu tuyến trùng IJs bằng phương pháp Whitetrap
Các xác ấu trùng BSL sau khi chết tiến hành thu ấu trùng cảm nhiễm bằng phương pháp whitetrap và thu IJs sau 10-15 ngày.
Hình 3.2. Thu tuyến trùng Ijs bằng phƣơng pháp Whitetrap
3.1.3. Quan sát hình ảnh của túi VKCS trong cơ thể tuyến trùng Steinernema sp. TĐ3
Hình 3.3. Hình ảnh vị trí của túi vi khuẩn cộng sinh trong cơ thể tuyến trùng Steinernema sp. TĐ3
Hình 3.3 cho thấy vi khuẩn cộng sinh nằm trong túi ở dưới thực quản. Túi vi khuẩn cộng
sinh trong cơ thể tuyến trùng
3.2. Phân lập vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Steinernema sp.TĐ3
3.2.1. Phân lập vi khuẩn cộng sinh
Các xác ấu trùng BSL ngay sau khi chết bởi tuyến trùng Steinernema
sp. TĐ3 được sử dụng để phân lập VKCS. Nuôi cấy trong tủ ấm ở 300
C trên môi trường NBTA trong 24- 48h. Quan sát khuẩn lạc thu được.
Hình 3.4. Khuẩn lạc vi khuẩn cộng sinh ở pha sơ cấp
Hình 3.5. Khuẩn lạc vi khuẩn cộng sinh ở pha thứ cấp
Hình 3.4 là hình ảnh khuẩn lạc ở pha sơ cấp có đặc điểm: khuẩn lạc to, trịn lồi, màu xanh đậm còn những khuẩn lạc ở pha thứ cấp (hình 3.5) có kích thước nhỏ hơn, trịn, lồi và màu đỏ nâu xẫm.
3.2.2. Quan sát các biến thể của VKCS
Cấy chấm điểm vào giữa đĩa thạch (có chứa mơi trường LB + 0,8% Agar) một vòng que cấy chủng vi sinh vật phân lập được, để trong tủ ấm ở 300C, 48-72h. Quan sát hình ảnh của khuẩn lạc.
Hình 3.6. Pha sơ cấp của VKCS Hình 3.7. Pha thứ cấp của VKCS
Khuẩn lạc của vi khuẩn ở pha sơ cấp có đặc điểm có đặc điểm là khuẩn lạc màu xanh, ở trên mơi trường có chứa 0,8%Agar thì các vi khuẩn có khả năng di động nên tạo nhu động (swamming ) xung quanh khuẩn lạc. Vùng quanh khuẩn lạc trong, một phần agar bị biến màu (hình 3.6).
Khuẩn lạc của vi khuẩn ở pha thứ cấp có đặc điểm là khuẩn lạc màu đỏ sẫm, không tạo thành vịng vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (hình 3.7).
Lựa chọn các vi khuẩn ở pha sơ cấp cấy vào ống thạch nghiêng có chứa môi trường NBTA để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3. Quan sát hình ảnh tế bào các chủng vi khuẩn cộng sinh
Làm tiêu bản giọt ép và quan sát hình ảnh tế bào các chủng vi khuẩn cộng sinh ở pha sơ cấp dưới kính hiển vi quang học thì thấy rằng các chủng vi khuẩn phân lập được có dạng hình que, chuyển động được.
Hình 3.8. Tế bào vi khuẩn cộng sinh
3. 3. Nghiên cứu khả năng kháng VSVKĐ của chủng VKCS
3.3.1. Sàng lọc sơ bộ khả năng kháng VSVKĐ
Các chủng VKCS sau khi xâm nhập vào cơn trùng vật chủ có thể tạo ra nhiều các sản phẩm trao đổi chất vừa có tác dụng gây sốc nhiễm trùng huyết vật chủ nhanh chóng, vừa giúp cho tuyến trùng cộng sinh với chúng có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng dễ dàng hơn. Trong những sản phẩm trao đổi chất (sơ cấp và thứ cấp), các chất kháng khuẩn, kháng nấm do VKCS sinh ra có vai trị ngăn chặn sự xâm nhập bất lợi của các VSV khác trong đất vào xác ấu trùng vật chủ, nhằm bảo vệ nguồn thức ăn cho tuyến trùng. Những VKCS này là nguồn VSV mới có thể sẽ hữu ích trong nghiên cứu khả năng sinh các hoạt chất kháng các tác nhân gây bệnh. Vì vậy, trong khn khổ luận văn thạc sĩ, sau khi phân lập được các chủng VKCS từ tuyến trùng Steinernema sp. TĐ3, tiếp tục đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật theo phương pháp thỏi thạch để sàng lọc, tuyển chọn các chủng có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cho các định hướng tiếp theo. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.