Các giai đoạn PCR Nhiệt độ (0
C) Thời gian (giây) Số chu kỳ
Biến tính ban đầu 96 120 1
Biến tính 96 30
25
Bắt cặp 50 30
Kéo dài 72 45
Kéo dài chu kỳ cuối 72 180 1
Giữ mẫu 4 Đến khi lấy mẫu
2.3.8.3. Phương pháp điện di DNA trên gen agarose
- Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 0.4g bột agarose hòa tan trong 40ml dung dịch TBE 1X, đun cho bột agarose tan hết. Khi gel hạ nhiệt độ xuống
khoảng 700C, đổ vào khn đã đặt sẵn lược điện di có độ dày răng lược thích hợp. Để gel đơng và ổn định hồn tồn trong khoảng 1h.
- Đặt gel vào bể điện di, đổ dung dịch TBE 1X ngập mặt gel và nhẹ nhàng rút răng lược ra.
- Tra mẫu: mẫu DNA được trộn với dung dịch màu loading dye theo tỷ lệ 5:1 và tra mỗi mẫu vào một giếng điện di theo thứ tự mẫu.
- Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100 V. Các phân tử AND sẽ chạy từ cực âm sang cực dương.
- Gel sau khi chạy điện di được lấy ra và ngâm vào dung dịch EtBr có nồng độ 0.05 μg/ml trong khoảng 15 phút để nhuộm DNA. Băng DNA trong gel có thể nhìn thấy trên máy soi gel bằng tia tử ngoại có bước sóng 302 nm.
Kết quả điện di cho các vạch gọn , phân tách rõ ràng nghĩa là DNA trong mẫu đảm bảo độ tinh sạch cho nghiên cứu.
Nếu các vạch kéo dài hoặc phân tách không rõ cần xử lý lai từ khâu xử lý protease K, để đảm bảo đô tinh sạch của mẫu nghiên cứu.
2.3.8.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng bộ kit MinElute của hãng QIAgen để tinh sạch sản phẩm PCR. - Sau khi chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, cắt đoạn gel chứa băng DNA của từng mẫu bằng dao nhỏ, sắc, sạch và cho vào ống eppepdof 1,5 ml
- Cân đoạn gel từng mẫu đã cắt. Thêm 3 lần thể tích dung dịch QG theo trọng lượng từng mẫu (1g gel tương đương 1000 μl dung dịch QG).
- Ủ ở 500C trong 10 phút cho tới khi gel tan hoàn toàn. Để làm tan gel tốt, lắc đều các ống eppendorf vài lần trong quá trình ủ, mỗi lần cách nhau 2 - 3 phút. Khi gel đã tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch mẫu. Màu của dung dich tốt là màu vàng của QG ban đầu.
- Hút toàn bộ dung dịch cho vào cột MinElute (gọi tắt là cột) đặt trong ống thu dich ly tâm (collection tube) của Kit và ly tâm 13.000 vòng/phút.
- Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác, cho 700 μl dung dịch PE vào cột, để mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, ly tâm ở 13.000 vòng/phút.
- Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác và ly tâm 13.000 vòng/phút - Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml đã ghi ký hiệu mẫu, cho 10μl EB vào cột và ly tâm 13.000 vòng/phút.
- Bỏ cột, bảo quản sản phẩm PCR trong ống eppendorf ở - 200C.
2.3.8.5. Phân tích trình tự DNA
Mẫu sau khi tinh sạch được giải trình tự với thành phần hỗn hợp phản ứng: