Giống Saccharomyces cĩ tới 18 lồi, nhưng chỉ cĩ 7 lồi thường gặp trong nước quả.
Các lồi nấm men khơng sinh bào tử thường gặp trong nước quả và khả năng lên men
hoặc tiêu hao đường trong đĩ, phổ biến là kloeckera, Torulopsis. Người ta thường gọi
chúng là men dại.
Các chủng nấm men thuần khiết thường sử dụng trong sản xuất rượu vang:
Saccharomyces vini
Trước đây nấm men này cĩ rất nhiều tên gọi khác nhau như: saccharomyces ellipsoideus, saccharomyces Meyer, saccharomyces cerevisiae Hansen.
Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả, chiếm tới 80% trong
tổng số saccharomyces cĩ trong nước quả khi lên men. Khả năng kết lắng của nĩ phụ
thuộc vào từng nịi: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bơng. Nguồn dinh dưỡng cacbon của lồi này là đường, cồn, acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotenic, biotin, mezoinozit, tiamin và piridoxin. Tế bào của chúng đa số hình ovan, cĩ kích thước vào khoảng (3 – 8) (5 – 12)m, sinh sản kiểu nẩy chồi và tạo bào tử.
Saccharomyces vini sinh ra enzim invertaza cĩ khả năng chuyển đường saccharoza
thành fructoza và glucoza, lượng rượu tạo thành từ 8 – 10% thể tích. Ở giai đoạn cuối
lên men saccharomyces vini kết lắng nhanh và làm trong dịch rượu. Các nịi của giống
này cĩ đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu sulphite, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp tạo ra cho vang cĩ mùi vị đặc trưng riêng biệt. Giai đoạn cuối
cùng của quá trình lên men, các tế bào saccharomyces vini thường bị già, khơng tiếp
Saccharomyces uvarum
Được tách từ nước nho, rượu và nước quả phúc bồn tử lên men tự nhiên. Chúng cĩ hình thái rất giống các lồi nấm men cĩ khả năng lên men cồn khác, nhưng khả năng tạo bào tử của chúng cao hơn rất nhiều các lồi nấm men khác (nhất là khi ta nuơi chúng trên mơi trường thạch- malt). Trong quá trình lên men, chúng cĩ khả năng tạo được lượng cồn rất cao (cĩ thể đạt được lượng cồn trong dịch lên men 12 – 13% V).
Saccharomyces oviformis
Nấm men này cĩ khả năng lên men dịch đường để tạo thành lượng cồn rất cao (cĩ thể lên đến 18%V). Được tách ra từ nước nho tự lên men, nhưng ít hơn và cĩ hình
thái giống saccharomyces vini. Chúng cĩ khả năng chịu được đường cao, cồn cao, lên
men kiệt đường do đĩ dùng nịi thuần chủng giống này lên men dịch quả cĩ hàm lượng đường cao để chế vang khơ cho kết quả tốt.
Đặc điểm quan trọng của nấm men này là cĩ khả năng lên men được rất nhiều loại đường khác nhau như: glucose, fructose, manose, saccharose, maltose và 1/3 rafinose, khơng cĩ khả năng lên men galactose. Điều khác cơ bản của chúng so với
saccharomyces vini là saccharomyces oviformis khơng lên men được galactose và
men nổi lên bề mặt dịch lên men tạo thành màng. Các nấm men được sử dụng trong sản xuất rượu vang thường thích hợp lên men ở nhiệt độ 18 – 25oC.
2.2.9. Cơ sở lý thuyết cuả quá trình lên men
2.2.9.1. Các quá trình lên men
Lên men theo nghĩa hẹp là thuật ngữ dùng để chỉ các quá trình phân giải các chất để thu năng lượng, trong đĩ hydro được tách ra từ một cơ chất (thường là glucoxit), được chuyển đến chất nhận cuối cùng là hợp chất hữu cơ. Oxy phân tử khơng tham gia vào quá trình lên men (sự phân giải yếm khí). Theo định nghĩa của Pasteur thì “sự lên men là sự sống khơng cĩ oxy phân tử”. Ví dụ trong lên men rượu hydro được tách ra trong quá trình phân hủy gluco kị khí được chuyển đến axetaldehyd (CH3CHO) hình thành trong quá trình đường phân để tạo etanol. Đối với tế bào thì ý nghĩa của sự lên men ở chỗ chúng thu được năng lượng ở dạng ATP, dự trữ cho cơ thể sinh vật.
Một chất hữu cơ cĩ thể lên men kị khí cĩ khả năng được oxy hĩa từng phần nhờ quá trình phân giải nội phân tử kèm theo quá trình giải phĩng năng lượng. Các chất cĩ thể lên men được chủ yếu là gluxit dạng đơn giản như monose, disaccarit… các loại axit amin (trừ axit amin cĩ nhân thơm), các base purin, pirimidin. Trong đĩ
quan trọng và dễ lên men được như steroit, tecpen… Các acid béo từ 50C trở lên chỉ trong điều kiện hiếu khí mới bị phân giải và oxy hĩa.
Ở vi sinh vật trong quá trình tiến hĩa đã hình thành nhiều kiểu lên men khác nhau. Dựa vào bản chất của sản phẩm chính cuối cùng của quá trình lên men cũng như các con đường trao đổi chất đặc trưng cho từng loại vi sinh vật mà người ta phân loại các quá trình lên men như: lên men rượu, lên men lactic, lên men do nấm men, do nấm mốc.
Ngày nay trong lĩnh vực cơng nghiệp cũng như trong thực tiễn đời sống người ta cĩ quan điểm quá trình lên men theo nghĩa rộng hơn. Quá trình lên men là quá trình trao đổi chất, qua đĩ các chất hữu cơ mà chủ yếu là đường bị biến đổi dưới tác dụng của enzym vi sinh vật. Sự hình thành các chất khác nhau xảy ra trong điều kiện kị khí hoặc hiếu khí (khơng cĩ oxy hoặc cĩ oxy tham gia).
Từ khái niệm mở rộng trên đây, dựa vào cơ chế phản ứng người ta đã chia sự lên men thành hai loại :
Lên men yếm khí (kị khí) :
Lên men yếm khí là sự biến đổi đường hay các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các chất đơn giản, dưới tác dụng của enzym vi sinh vật, trong điều kiện khơng cĩ sự tham gia của oxy phân tử. Đây chính là sự lên men theo đúng định nghĩa lên men của Pasteur đã nĩi trên. Thuộc loại lên men này cĩ lên men rượu, lactic, aceton- butylic…
Lên men hiếu khí :
Lên men hiếu khí là dạng lên men theo nghĩa mở rộng hơn, là quá trình phân giải đường hay các chấc hữu cơ khác thành sản phẩm đơn giản, dưới tác dụng của enzym vi sinh vật trong điều kiện cĩ oxy tham gia. Thuộc loại này cĩ lên men a.acetic, lên men citric, a.glutamic…
Trong cơng nghiệp lên men, người ta thường sử dụng các vi sinh vật khác nhau làm nguồn cung cấp enzym và chuyển hĩa các chất như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn Dựa vào đối tượng cung cấp hệ enzym người ta cũng cĩ thể chia lên men ra ba nhĩm chính :
- Lên men nhờ nấm men như: lên men rượu, glyxerin, bia, rượu vang, bánh mì, men gia súc.
- Lên men nhờ nấm mốc như: lên men a.citric, a-gluconic, a-fumaric, penixilin, Streptomyxin…
- Lên men nhờ vi khuẩn như: lên men acetic, a. lactic, a.butiric, aceton-butilic… Do những đặc điểm khác nhau về nguồn enzym từ các chủng loại vi sinh vật khác nhau, cơ chế của sự lên men rất đa dạng… mà ta thu được các sản phẩm lên men rất đa dạng, phong phú, nhiều loại, đáp ứng nhu cầu về đời sống của con người.
2.2.9.2. Bản chất của quá trình lên men
Dầu các quá trình lên men cĩ khác nhau về hình thức, cơ chế, tiến trình phản ứng, sản phẩm cuối và hệ vi sinh vật tham gia, hệ enzym xúc tác… Nhưng các quá trình lên men cĩ bản chất cơ bản giống nhau.
Các phản ứng sinh hĩa xảy ra trong quá trình lên men là những phản ứng chuyển hydro và điện tử (e- và H+). Các enzym xúc tác cho quá trình này là các enzym oxy hĩa khử (dehydrogenase, oxydase…) chủ yếu từ vi sinh vật. Như vậy: thực chất các quá trình lên men là các quá trình oxy hĩa – khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian..
Năng lượng này rất cần thiết cho hoạt động sống của sinh vật như sinh trưởng, phát triển, sinh sản…
Tùy theo chủng vi sinh vật, mơi trường, và điều kiện lên men chúng ta thu được các sản phẩm chính, phụ khác nhau.
Trong q trình oxy hĩa khử sinh học, hydro được tách khỏi cơ chất ban đầu nhờ enzym dehydrogenase, và chuyển đến những chất tiếp nhận khác nhau. Tùy theo chất tiếp nhận hydro từ cơ chất mà người ta phân biệt các dạng lên men và hơ hấp như sau:
Trong lên men yếm khí (lên men theo định nghĩa của Paster) khơng cĩ sự tham
gia của oxy phân tử, hydro được tách ra khỏi cơ chất và chuyển đến chất nhận là chất hữu cơ chưa no. Sau khi nhận hydro các chất này tạo thành các chất hữu cơ nhất định, đây chính là sản phẩm của quá trình lên men tích tụ trong mơi trường (ví dụ etanol, acid lactic…). Trong lên men rượu hydro được tách ra trong quá trình phân hủy glucose, được chuyển hĩa đến acetaldehyt (CH3CHO) hình thành trong quá trình đường phân và tạo thành etanol trong điều kiện thiếu oxy, chất này hoạt động như chất nhận hydro và bị khử thành etano, và đồng thời tái sinh NAD từ NADH2.
Trong hơ hấp hiếu khí (lên men hiếu khí). Hydro được tách ra từ cơ chất hữu cơ
trải qua hàng loạt các giai đoạn trung gian, cuối cùng kết hợp với oxy để tạo ra H2O. Ví dụ acid pyruvic, bị oxy hĩa hồn tồn trong chu trình Kreb, qua hàng loạt sản phẩm trung gian cuối cùng tạo CO2 và H2O và giải phĩng năng lượng. Quá trình hơ hấp hiếu khí giải phĩng ra năng lượng lớn cung cấp cho quá trình hoạt động sống của cơ thể vi sinh vật. Nguyên liệu của quá trình oxy hĩa (hơ hấp hiếu khí) chủ yếu là gluxit, sáp, chất béo… Sản phẩm cuối cùng này là CO2 và H2O và một số sản phẩm trung gian do oxy hĩa khơng hồn tồn như a.acetic, a.citric…
Các vi sinh vật sống trong điều kiện hiếu khí thường cĩ thể sống trong điều kiện
kị khí hoặc kị khí khơng bắt buộc hồn tồn. Chất nhận điện tử và hydro cuối cùng khơng phải oxy mà là nitrat hay sulfat. Kiểu chuyển điện tử và H+ này giúp cho vi khuẩn oxy hĩa hồn tồn cơ chất mà khơng cần sự tham gia của oxy phân tử. So với q trình lên men trong hơ hấp kị khí vi sinh vật thu được nhiều năng lượng hơn.
Tĩm lại trong thực tiễn sản xuất hiện nay người ta chỉ phân biệt hai dạng lên men là lên men hiếu khí (cĩ oxy tham gia) và lên men yếm khí (khơng cĩ oxy tham gia) đơi khi cịn gọi là lên men kị khí.
2.2.9.3. Cơ chế của quá trình lên men rượu
Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thụ qua bề mặt tế bào rồi thẩm thấu vào bên trong. Ở đĩ, các enzym sẽ tác dụng qua nhiều giai đoạn trung gian để cuối cùng tạo ra sản phẩm chính là rượu và khí cacbonic. Hai chất này đều khuếch tán và tan vào mơi trường xung quanh. Rượu do rất linh động nên hịa tan nhanh trong dịch lên men, cịn khí CO2 hịa tan kém và khuếch tán chậm. Lúc đầu hịa tan hồn tồn, dần dần tạo thành các bọt khí bám quanh tế bào men và lớn dần đến mức lực đẩy Archimèdes lớn hơn tế bào men cộng bọt khí, lúc đĩ tế bào men và bọt khí nổi dần lên, khi đến bề mặt các bọt khí vỡ ra. Bọt khí tan, tế bào men lại chìm dần. Q trình trên lại lập lại. Khi đường và các chất dinh dưỡng trong canh trường cịn ít, một lượng lớn tế bào men sẽ lắng xuống đáy, dịch lên men trong dần. Xét về mặt hĩa học, sự lên men rượu bình thường cĩ thể chia ra hai thời kỳ: thời kỳ cảm ứng và thời kỳ tĩnh.
Thời kỳ cảm ứng
Ở giai đoạn này, chất tiếp nhận hydro của enzym alcoldehydrogenaza là acetaldehyd được tạo thành chưa đủ, do đĩ enzym sẽ chuyển hydro đến cho aldehyd phosphatglixerinic. Dưới tác dụng của enzym phosphataza, phosphatglixerin bị thuỷ phân để tạo thành glixerin. Như vậy trong mơi trường sẽ hình thành glixirin và CO2.
Thời kỳ tĩnh
Đến lúc này,lượng acetaldehyd là cơ chất bình thường của enzym alcoldehydrogenaza được tạo thành đã cĩ nhiều, nên enzym sẽ chuyển hydro đến cho cơ chất của nĩ và rượu etylic được tạo thành từ đây
Glixerin chỉ được tạo nên trong thời kỳ cảm ứng nên nĩ sẽ chỉ là sản phẩm phụ trong mơi trường acid.
Phương trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men [1]
Thực tế cho thấy rằng, sự lên men rượu sẽ xảy ra một cách bình thường để cho ta sản phẩm chủ yếu là rượu và một số sản phẩm phụ khác như glixerin. Chỉ trong điều kiện pH của mơi trường từ 4-5 và mơi trường thật yếm khí. Trong điều kiện yếm khí sự lên men xảy ra rất mạnh mẽ (nghĩa là etanol tạo thành sẽ nhiều) nhưng sự phát
C6H1 2O6 C H2O P C H O H C H = O C H2O P C H O H C H2O H P p h osph ataza C H2O H C H O H C H2O H N A D .H2 N A D+
p ho sph atglixe rin glix erin
C6H12O6 CH2O P CHOH CH = O CH2OP CHOH CH2OH P CH2OH CHOH CH2OH CH3 CH = O glixerin CH3 CH2OH + CO 2 NAD.H2 NAD+ phosphatglixerin Acetaldehit etanol CH3 C= O COOH O H ATP CO OH H C PO H ADP O H C6 12 6 2 2 3 4 2 2 5 2 2 2 2 2
triển của tế bào nấm men hầu như khơng cĩ. Vì khi ấy nấm men cĩ thể thu được năng lượng để duy trì cho các hoạt động sống của mình chỉ bằng cách lên men glucose. Khi cĩ khơng khí thì sự lên men yếu đi vì nấm men sẽ thu năng lượng cần thiết cho sự phát triển của chúng bằng con đường hơ hấp hiếu khí, nghĩa là bằng cách oxi hĩa sinh học glucose đến CO2 và H2O.
Hình 2.11:Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men (theo con đường EMP)
Glucose Hexokinaza Glucose – 6 – phosphat Photphoglucoza isomeraza Fructose – 6 – phosphat PhosphoFructokinaza Fructose – 1,6 – diphosphat Aldolaza Triophosphat izomeraza
Glyceraldehyd – 3 – phosphat Dihydroxy aceton phosphat Glyceraldehyd phosphatdehydrogenaza Acid – 1,3 – diphosphoglyceric Phosphoglyceratkinaza Acid – 3 – phosphoglyceric Phosphoglycerat-mutaza Acid – 2 – phosphoglyceric Enolaza Acid phosphoenolpyruvic Pyruvat kinaza Acid pyruvic Pyruvate – decarboxylaza Acetaldehyd Aldodeshydrogenaza Ethanol
2.2.9.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
Thực chất cuả quá trình lên men rượu là quá trình chuyển hố đường thành etanol nhờ vào hoạt động cuả nấm men. Do vậy các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hoạt động cuả men cũng là các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu.
Ảnh hưởng cuả nồng độ đường trong dịch lên men
Nồng độ đường trong dịch lên men ảnh hưởng đến hiệu suất, hoạt động cuả nấm men, quá trình lên men. Đuờng cung cấp nguồn carbon là nguồn thức ăn cho nấm men hoạt động.
Hàm lượng đường khá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là đường nhiều sẽ dẫn đến ức chế khơng những tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặc khác, đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc kéo dài thời gian lên men. Nếu hàm lượng đường quá thấp khơng đủ cơ chất cho nấm men hoạt động, sẽ giảm hiệu suất lên men, khơng tạo được độ cồn mong muốn trong rượu vang.
Trong nước quả thường cĩ hàm lượng đường khơng đều, do đĩ người ta thường bổ sung thêm đường saccharose. Thơng thường, các loại nấm men hoạt động bình thường trong mơi trường cĩ hàm lượng đường 10 – 25%, nồng độ đường cao hơn 25 % trở lên thì sự lên men khĩ khăn và chậm chạp. Ở nồng độ đường 30-35% sự lên men gần như bị đình chỉ.
Ảnh hưởng cuả pH
pH cĩ ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men, tạo sản phẩm chính và phụ khác nhau. Nếu pH 4 – 5 lên men rượu bình thường tạo sản phẩm chính là etanol. Nếu pH mơi trường là kiềm thì sản phẩm chính là glycerin. Để điều chỉnh acid thường dùng acid citric hay acid lactic.
Thực tế cho thấy khi lên men những dịch quả chua thường cho rượu vang ngon. Mặt khác pH dịch lên men càng acid thì càng hạn chế được hoạt động của nhiều loại vi khuẩn. Đối với dịch quả thường cĩ độ pH từ 2.8 – 3.8. Khoảng pH này nấm men vẫn hoạt động được.
Ảnh hưởng cuả nguồn Nitơ
Tùy nguồn nguyên liệu ban đầu cĩ thể bổ sung hay khơng bổ sung nguồn dinh dưỡng nitơ cho nấm men. Tùy thuộc vào đặc tính của từng nguyên liệu mà cĩ thể sử dụng (NH4)2SO4, NH4H2PO4, NH4NO3 nước chiết nấm men, pepton...
Ảnh hưởng cuả nhiệt độ
Nhiệt độ lên men ảnh hưởng đến nấm men, quá trình lên men, chất lượng sản phẩm. Nhiệt độ thấp thì quá trình lên men kéo dài nhưng chất lượng, hương vị rượu tốt hơn. Nhiệt độ lên men càng cao thì thời gian lên men càng ngắn nhưng hàm lượng các chất khơng mong muốn (aldehyd, diacetyl, furfurol...) càng cao, hàm lượng rượu