Chƣơng 1 .TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. và Cl. perfringens phân lập được ở lợn con bị tiêu chảy và bình thường tại 3 tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang và Vĩnh Phúc.
* Địa điểm nghiên cứu: Thái Nguyên - Vĩnh Phúc –Bắc Giang và Viện Thú y Quốc gia Hà Nội
* Thời gian nghiên cứu: Năm 2008 đến năm 2011 2.2.2. Nguyên liệu và dụng cụ, trang thiết bị
2.2.2.1. Nguyên liệu
- Động vật thí nghiệm
+ Chuột bạch: khỏe mạnh, cĩ trọng lượng 18- 20 gram/con. + Lợn nuơi ở Thái Nguyên, Bắc Giang và Vĩnh Phúc.
- Giống : Giốngvi khuẩn sử dụng sản xuất autovacxin và kiểm nghiệm: Là
vi khuẩn E. coli và Salmonella: các chủng được chọn là vi khuẩn cĩ độc lực cao, kháng nguyên tính cao và ổn định được phân lập được từ lợn con tiêu chảy tại 3 tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang và Vĩnh Phúc.
2.2.2.2. Các loại mơi trường, hĩa chất và dụng cụ, thiết bị
- Mơi trường đưa vào sản xuất vacxin: Tryptic soy brorth, BHI broth, Yeast Extract, huyết thanh bê, chất chống bọt (antifoam).
- Các mơi trường kiểm tra tự chế gồm: nước thịt ống, nước thịt lọ 50ml, thạch máu, thạch thường, thạch nấm, yếm khí.
- Các loại mơi trường dùng nuơi cấy và phân lập vi khuẩn như XLD agar (Xylose Lysine Deoxycholate Agar), MacConkey agar, thạch máu, thạch thường, thạch Endo, EMB (Eosin-metyl- Blue)... và các mơi trường đường, Kligler, VP (Voges Proskauer), MR (Metyl Red)...
- Mơi trường pepton water Muller Kauffmann và Rappaport Vassiliadis enrichment Broth.
- Các mơi trường nước gan, thạch máu, nước thịt, ĩc yếm khí... tự chế, dùng nuơi cấy và phân lập vi khuẩn Cl. perfringens.
- Các loại kháng huyết thanh E.coli và Salmonella là Poly OH, O, H và K. - Hố chất: NaOH 2N, H2SO420%, cồn 700
, phèn chua….
- Giấy tẩm kháng sinh các loại do hãng Oxoid của Anh, Biorad ...
- Sử dụng trang thiết bị sẵn cĩ của Bộ mơn Vi trùng, Phân xưởng sản xuất vacxin Vi trùng, phịng kiểm nghiệm vacxin như: máy mĩc, dụng cụ, máy lên men Bio 110 và các linh phụ kiện,vật liệu...vv… tại phịng nghiên cứu của Bộ mơn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia.
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc và tại phịng nghiên cứu của Bộ mơn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phƣơng pháp điều tra
- Dựa theo phương pháp điều tra nghiên cứu của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002) [52]; Nguyễn Như Thanh và cs (1996) [47].
2.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu và phân lập vi khuẩn
2.3.2.1. Mẫu nghiên cứu
* Mẫu phân: lấy khoảng 3-5 gam, đựng trong ống nghiệm vơ trùng, cĩ nút vặn để tránh sự nhiễm tạp kế phát.
* Mẫu bệnh phẩm: Máu tim, gan, lách, hạch màng treo ruột, phổi, ruột non, ruột già... đựng trong túi nylon vơ trùng.
Các mẫu được ghi rõ số liệu, bảo quản nghiêm ngặt trong điều kiện lạnh ở 4oC, theo Quy trình nghiên cứu vi sinh vật của Viện Thú y Quốc gia.
2.3.2.2. Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn
Các phương pháp nuơi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn E. Coli, Salmonella spp., Cl. perfringens được thực hiện theo Quy trình nghiên cứu vi trùng thường quy của Viện Thú y Quốc gia.
* Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn
Mẫu được pha lỗng ở nồng độ b, cấy 0,2 ml mẫu cần nghiên cứu vào thạch đặc trong đĩa Petri, rồi đếm số khuẩn lạc (CFU) trên máy đếm (Nguyễn Bá Hiên và cs 2010) [15].
Số lượng vi sinh vật X trong 1 gam phân được tính theo cơng thức: X = 5.a.b
Trong đĩ: a: là số lượng CFU trung bình trên một đĩa petri b: độ pha lỗng mẫu
Hệ số 5: do cấy 0,2 ml (vì cần đếm số lượng vi khuẩn/1ml)
2.3.3. Nghiên cứu đặc tính sinh vật học của vi khuẩn
* Vi khuẩn E.coli, Salmonella:
Nghiên cứu đặc tính sinh vật học của vi khuẩn dựa vào khả năng mọc trên các mơi trường nuơi cấy, nhuộm màu Gram, khả năng di động, hình dạng, kích thước, lên men đường theo phương pháp thường quy, gồm:
- Xác định hình thái và tính chất bắt màu bằng phương pháp nhuộm Gram. - Đánh giá tính chất và đặc điểm mọc trên các mơi trường lỏng
- Xác định khả năng di động: dùng mơi trường thạch mềm (Motility Test Medium) hoặc theo phương pháp giọt treo.
- Khả năng lên men đường, phản ứng sinh Indol …vv.. * Vi khuẩn Cl. perfringens:
- Trong mơi trường nước gan: Vi khuẩn phát triển mạnh, nhanh làm đục và thay đổi màu mơi trường từ vàng trong sang vàng đục, sinh nhiều hơi.
- Trong mơi trường thạch glucose cĩ 7% máu cừu: ở 37oC trong 24-36 giờ (cĩ 10% CO2) vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc hình cúc áo, rìa nhẵn màu xám nhạt, xung quanh khuẩn lạc cĩ hai vịng dung huyết đồng tâm.
- Trong mơi trường gelatin: Khuẩn lạc nhỏ, trịn và làm tan chảy gelatin - Trong mơi trường thạch Veillon: Vi khuẩn hoạt động mạnh, sinh nhiều hơi, làm nứt thạch.
- Trong mơi trường nước thịt cĩ ĩc: Vi khuẩn làm chuyển màu nước thịt thành màu tro đục, cĩ hiện tượng sinh hơi và làm đen ĩc.
- Trong mơi trường sữa bị cĩ 7% chỉ thị Litmus: ở 37oC trong 24 giờ, vi khuẩn lên men sinh hơi mạnh, sinh nhiều axit, làm mất chất chỉ thị màu, gây đơng vĩn sữa.
- Phương pháp giọt treo: các chủng vi khuẩn Cl. perfringens phân lập được đều khơng cĩ khả năng di động.
2.3.4. Phƣơng pháp xác định type kháng nguyên của vi khuẩn phân lập đƣợc
2.3.4.1. Vi khuẩn E. coli
- Thực hiện phản ứng nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh chuẩn đơn giá và đa giá.
Sau đây là sơ đồ tĩm tắt quy trình phân lập và giám định vi khuẩn E. Coli.
Sơ đồ 1: Phân lập và giám định E. coli
2.3.4.2. Vi khuẩn Salmonella spp
Sơ đồ 2: Phân lập và giám định Salmonella (Carter., 1995) [78] (Carter., 1995) [78]
2.3.4.3. Vi khuẩn Cl. perfringens
Sơ đồ 3: Phân lập và giám định vi khuẩn Clostridum ( Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2011) [25] ( Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2011) [25]
2.3.5. Phƣơng pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập đƣợc
2.3.5.1. Phương pháp PCR để xác định một số gen qui định yếu tố độc lực cĩ trong ADN của vi khuẩn E. coli phân lập được
Sự cĩ mặt của một số yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli cĩ trong ADNA
của các mẫu dương tính với vi khuẩn E. coli được xác định bằng phương pháp
PCR như đã được mơ tả bởi Đỗ Ngọc Thúy và cs (2005) [58], với một số cải tiến. Cĩ thể tĩm tắt như sau:
- Tách chiết ADN mẫu (ADN đích): Hịa tan vào 1 ml nước cất (khử ion) 3- 5 khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli (đại diện cho tập hợp các vi khuẩn E. coli phân
lập được từ 1 mẫu phân của 1 lợn) đã được nuơi cấy trên đĩa thạch máu cừu (37oC/24 giờ). Đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút. Sau đĩ, đặt ngay vào đá lạnh trong 10 phút. Ly tâm với tốc độ 12.000 vịng/phút trong 10 phút. Chất trong ở trên được sử dụng làm ADN mẫu (ADN template).
- Phản ứng PCR:
Hỗn hợp phản ứng (25 l) gồm 2,5 l 10 x PCR buffer (750 mM Tris-HCl (pH 8,8), 200 mM (NH4)2SO4, 0,1% (v/v) Tween20); 2 mM MgCl2; 200 M dNTP mỗi loại (dATP, dCTP, dGTP and dCTP) (Life Technologies), 1 l primer (3,2 M/l); 0,25 U Taq DNA polymerase (Advanced Biotechnologies), DNA của chủng vi khuẩn cần kiểm tra (lấy trực tiếp từ khuẩn lạc vi khuẩn trên mơi trường thạch máu) và nước cất (Gibco, BRL) vừa đủ 25 l.
Phản ứng PCR được tiến hành trong máy nhân gen (Eppendorf) theo các chu trình như sau: 94oC/5 phút (1 chu kỳ); 94o
C/1 phút, Tm/1 phút, 72oC/1 phút (30 chu kỳ); 72oC/7 phút, trong đĩ Tm là nhiệt độ tan chảy thích hợp của mỗi loại primer.
* Chạy điện di:
Điện di: Các sản phẩm ADN thu được sau quá trình PCR được tiến hành chạy điện di trên thạch agarose 2% (Gibco, BRL) với hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (Loading dye), trộn vào mẫu theo tỉ lệ 1:5. Sau khi nhuộm sản phẩm PCR được chạy điện di trên Gel Agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris- Acetate- EDTA) với hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
* Nhuộm:
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium Bromide (1 µl/ml) trong vịng 15 phút.
- Nhuộm với TAE cĩ bổ sung Ethidium bromide trong 15 phút. Các sản phẩm được quan sát dưới đèn UV (300 nm), dùng hệ thống Gel Doc 2000 (Bio- Rad). Ảnh được lưu giữ lại và tiến hành xử lý kết quả khi cần thiết.
2.3.5.2. Phương pháp kiểm tra một số yếu tố độc lực (độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) của các chủng Salmonella bằng phương pháp PCR
Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm
Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp)
Stn- F Stn- R 5’- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3’ 5’- TGCCCAAAGCAGAGAGATTC- 3’ 259 InvA- F InvA- R 5’- TTGTTACGGCTATTTTGACCA- 3’ 5’- CTGACTGCTACCTTGCTGATG- 3’ 521 104SR- F 104SR-R 5’- GTCAGCAGTGTATGGAGCGA- 3’ 5’- AGTAGCGCCAGGACTCGTTA- 3’ 162 * Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới đèn UV (300 nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc. Kích thước các băng DNA được so với DNA chuẩn (DNA marker).
2.3.5.3. Phương pháp xác định khả năng dung huyết của các chủng vi khuẩn
Vi khuẩn E. coli được cấy trực tiếp trên thạch máu cừu, bồi dưỡng ở 37oC/24 giờ, sau đĩ nuơi ở nhiệt độ thường phịng thí nghiệm khoảng từ 2-3 giờ để dung huyết diễn ra hồn tồn. Đánh giá dạng dung huyết α, β hoặc γ
căn cứ vào đặc điểm dung huyết (Cù Hữu Phú và cs, 2004) [34]. - Dung huyết α: dung huyết mờ khơng hồn tồn.
- Dung huyết β: dung huyết trong hồn tồn. - Dung huyết γ: khơng cĩ dung huyết.
Vi khuẩn Cl. perfringens cĩ đặc điểm là gây dung huyết kép trên thạch máu. Vì vậy, để xác định khả năng dung huyết của các chủng Cl. perfringens sử dụng CAM test ngược.
2.3.5.4. Phương pháp xác định kháng nguyên bám dính của vi khuẩn trích theo phương pháp của Cù Hữu Phú và cs (2004) [34].
- Chuẩn bị kháng nguyên
Tiến hành rửa các chủng vi khuẩn trên bề mặt các mơi trường thạch đĩa bằng dung dịch nước muối sinh lý 0,85%, sau đĩ thu lấy huyễn dịch vi khuẩn hoặc bồi dưỡng trong canh khuẩn cĩ lắc để đạt khoảng 108
vi khuẩn/ml, bảo quản huyễn dịch thu được ở 4o
C.
Máu cừu khoẻ mạnh được lấy vào bình cĩ Citrat natri, máu được rửa ba lần bằng dung dịch Phosphat Buffer Saline (PBS) bằng cách ly tâm 3000 vịng/phút trong 30 phút. Sau lần rửa thứ ba, gạn bỏ phần nước trong phía trên và giữ lại hồng cầu, bảo quản ở 4oC. Khi tiến hành phản ứng, pha hồng cầu cừu với nước muối sinh lý thành nồng độ 3%.
Do vi khuẩn Salmonella spp. cĩ kháng nguyên bám dính là CFA1 nên sử dụng hồng cầu cừu để tiến hành làm phản ứng.
- Tiến hành làm phản ứng
Phản ứng được thực hiện trên khay Takashi (khay nhựa 96 lỗ), các bước tiến hành như sau:
+ Bước 1: Dùng micropipet nhỏ vào mỗi giếng 0,025 ml dung dịch nước
muối sinh lý 0,85%.
+ Bước 2: Cho vào lỗ thứ nhất 0,025 ml canh khuẩn chuẩn bị ở trên rồi
pha huyễn dịch vi khuẩn theo hệ số 2: (l/2, 1/4, 1/8, 1/16 ... ) ở 8 lỗ hàng cuối cùng khơng pha, để nguyên nước muối sinh lý làm đối chứng.
+ Bước 3: Cho vào mỗi lỗ huyễn dịch trên 0,025 ml hồng cầu cừu 3%.
Lắc nhẹ nhàng khay nhựa cho các thành phần hồ trộn đều vào nhau, đậy kín khay và để ở 4o
C, sau 2-4 giờ đọc kết quả. Đánh giá kết quả:
Phản ứng (+): Xuất hiện ngưng kết hồng cầu, đánh giá theo 4 cấp độ sau: (+): Khi cĩ khoảng 25% lượng hồng cầu ngưng kết
(++): Khi cĩ khoảng 50% lượng hồng cầu ngưng kết (+++): Khi cĩ khoảng 75% lượng hồng cầu ngưng kết (++++): Khi cĩ 100% lượng hồng cầu ngưng kết
Phản ứng (-): Khơng cĩ ngưng kết hồng cầu và giống như đối chứng.
2.3.5.5. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn trích theo phương pháp của Cù Hữu Phú và cs (2004) [34].
Để xác định độc lực của các vi khuẩn gây bệnh thực hiện bằng phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm.
* Xác định độc lực của vi khuẩn E. coli và Salmonella spp.:
- Bước 1: Các chủng vi khuẩn thuần từ mơi trường giữ giống được cấy
chuyển vào mơi trường BHI trong bình tam giác l00 ml, sau đĩ canh trùng được bồi dưỡng ở 37oC/24 giờ, quá trình nuơi cĩ lắc kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn.
- Bước 2: Đếm số lượng vi khuẩn trong 1 ml canh khuẩn sau nuơi 24 giờ. - Bước 3: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu vào phúc xoang cho 2
chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, khối lượng từ 18-20 gr với liều 0,2 ml/chuột. Mỗi lơ để 2 chuột tiêm dung dịch B.H.I. làm đối chứng.
- Bước 4: Cho chuột ăn, uống bình thường và theo dõi những biểu hiện, triệu chứng phản ứng sau tiêm. Kiểm tra và đánh giá số chuột chết tới 5 ngày. Căn cứ vào thời gian và số lượng chuột thí nghiệm chết của mỗi lơ để đánh giá độc lực của vi khuẩn.
- Bước 5: Những chuột chết được kiểm tra lâm sàng, mổ khám quan sát
các cơ quan nội tạng cĩ những bệnh tích điển hình như mắc bệnh tự nhiên, khi nuơi cấy và phân lập lại vi khuẩn cho kết quả dương tính là cơ sở để đánh giá độc lực của vi khuẩn kiểm tra.
* Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Cl. perfringens
Các chủng vi khuẩn Cl. perfringens cần xác định được nuơi cấy trong mơi trường nước thịt gan yếm khí ở 37o
C/24-36 giờ. Phương pháp tiến hành xác định và phân lập lại vi khuẩn Cl. perfringens giống như đối với E. coli hoặc
Salmonella spp.
2.3.6. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được trích theo phương pháp của Cù Hữu Phú và cs (2004) [34]. khuẩn phân lập được trích theo phương pháp của Cù Hữu Phú và cs (2004) [34]. 2.3.6.1. Vi khuẩn E. coli và Salmonella spp
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa
thạch và đánh giá kết quả theo các tiêu chuẩn lâm sàng phịng thí nghiệm của Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ.
2.3.6.2. Vi khuẩn Cl. perfringens
Các chủng vi khuẩn Cl. perfringens được nuơi trong thạch máu Columbia Blood Agar Base yếm khí ở 37o
C/24-36 giờ. Phương pháp đánh giá giống như đối với vi khuẩn E. coli hoặc Salmonella spp..
2.4. XÂY DỰNG PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ TIÊU CHẢY Ở LỢN CON
Sau khi xác định khả năng mẫn cảm với các kháng sinh, hĩa dược của các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập được bằng phương pháp kháng sinh đồ, trên cơ sở đĩ lựa chọn loại kháng sinh và xây dựng phác đồ điều trị hội chứng tiêu chảy thích hợp cho lợn con. Để đánh giá hiệu quả khách quan, các phác đồ được thực hiện cĩ sự đồng đều tương đối về các tiêu chí cơ bản sau:
- Số lợn con tiêu chảy ở cùng một địa điểm được phân ra một cách ngẫu nhiên làm 3 lơ tương ứng với 3 phác đồ điều trị bệnh.
- Số lần và ngày điều trị được dùng đồng đều trong các phác đồ.
- Trong các phác đồ, sự khác nhau là sử dụng và kết hợp kháng sinh với các hĩa dược khác.
2.5. PHƢƠNG PHÁP CHẾ TẠO AUTOVACXIN VƠ HOẠT CĨ BỔ TRỢ KEO PHÈN
Vacxin vơ hoạt cĩ bổ trợ keo phèn được chế theo phương pháp thường quy của Bộ mơn Vi trùng - Viện Thú y, theo sơ đồ 5.
Vacxin được kiểm nghiệm theo quy trình vacxin vơ hoạt cĩ bổ trợ keo phèn của Trung tâm kiểm nghiệm thuốc Thú y TW - Cục Thú y. Nguyễn Bá Hiên và cs (2010) [15].
Nuơi cấy vi khuẩn bằng cơng nghệ lên men sục khí trong sản xuất vacxin.
* Các phƣơng pháp thƣờng quy đƣợc sử dụng
*Nhuộm và soi kính: sử dụng phương pháp nhuộm Gram
* Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn được tính theo cơng thức dưới đây với đơn vị tính là CFU:
X = a x N x 10
Trong đĩ: X: Số lượng tế bào vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn.
N: Hệ số pha lỗng.
a: Số vi khuẩn cĩ trong 0,1 ml canh khuẩn pha lỗng. * Kiểm tra thuần khiết và vơ trùng
Áp dụng theo Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y