Phƣơng pháp tiến hành
Cho dịch vi khuẩn E. Coli vào các đĩa petri có chứa dung dịch nano vàng – chitosan. Tiến hành mẫu đối chứng tương tự với mẫu không chứa dung dịch nano vàng – chitosan. Sau các khoảng thời gian 5, 10, 15, 20, 24 giờ, mẫu có chứa dung dịch nano vàng này được pha loãng đến 104, 105, 106. Từ mỗi độ pha loãng lấy ra
100μl đem trải lên đĩa môi trường Nutrient Agar. Ủ ở 37o
C trong 24 giờ rồi đếm số khuẩn lạc thu được.
Cách tính kết quả: Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa. Dùng những đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 (theo FDA) để tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu:
Mi (CFU/ml) = Ai * Di/V (2.1)
Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình trong đĩa Di là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình Mi trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
Hiệu suất kháng khuẩn được xác định theo công thức sau
η = ( N1-N2 )/ N1 * 100% (2.2)
Trong đó: N1 là số khuẩn lạc trong đĩa đối chứng.
2.2.4. Phƣơng pháp tạo nền kem.
Hình 2.11: Sơ đồ tạo nền kem.
Bước 1: Lấy 4,5g Emuldage SE-PE, 3g polyethyleneglycol 6000, 0,05g
EDTA trộn với nhau. Sau đó thêm 3g glycerin và nước vào được 100ml dung dịch để được tướng. Khuấy hỗn hợp ở 80oC, 700 vòng/phút để được hỗn hợp đồng nhất.
Bước 2: Lấy 1,5g Cetyl alcohol, 3g isopropyl myristate, 1g glycerin
monostearate, 0.25g phenopin trộn với nhau. Sau đó thêm 0,5g lanolin được tướng dầu. Khuấy hỗn hợp ở 80oC, 700 vòng/phút để được hỗn hợp đồng nhất, trong suốt.
Bước 3: Trộn tướng nước và tướng dầu với nhau, khuấy trong vòng 45 phút.
Sau đó, lấy ra để ổn định ở 40oC thu được nền kem. Phối dung dịch nano vàng vào nền kem, sau đó bảo quản tối. Sản phẩm thu được xác định tính chất hóa lý như kiểm tra độ cứng, khả năng kích ứng da của kem.
Tướng nước Tướng dầu
Nền kem
Tướng dầu gia nhiệt đến 80oC,
khuấy cho tan hoàn toàn (700v/ph)
Tướng nước gia nhiệt 80o
C, khuấy 700v/ph Khuấy 700v/ph, 80oC, 45phút Kiểm tra độ cứng Độ kích ứng da Hàm lượng vàng trong kem
2.2.5. Các phƣơng pháp phân tích mẫu kem nền và kem nano vàng – chitosan. 2.2.5.1. Phƣơng pháp đo độ lún kim.
- Độ lún kim biểu thị độ mềm và độ xốp của kem. - Thực hiện
+ Dùng một kim A cỡ kim lượt dài 13mm đầu nhọn, có trọng lượng = 0.0788g nhưng không quá nhọn, cho rơi tự do qua một ống thủy tinh B hình trụ hai đầu bằng, dài 50cm, đường kính 1cm và được đặt cách hộp kem 1-2cm.
+ Khi kim lún vào kem, nâng ống B lên, rút kim ra và đo độ lún vào kem của kim (tính bằng mm), đo mỗi mẫu 3 lần và lấy trị số trung bình.
Hình 2.12: Phương pháp đo độ lún kim
2.2.5.2. Phƣơng pháp kiểm tra độ độc hại (độ kích ứng da).
Yêu cầu kỹ thuật
Kích ứng da: từ không kích ứng đến kích ứng không đáng kể.
Phương pháp thử Theo ISO 10993 – 10:2002.
Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm:
Cây kim kiểm tra độ lún của kem
Ống thủy tinh thẳng
+ Thiết bị thích hợp để làm sạch lông thỏ. + Bông, gạc và băng keo y tế.
+ Kéo.
Động vật và điều kiện thí nghiệm.
Sử dụng thỏ trắng trưởng thành, đực hoặc cái (không sử dụng thỏ có chữa hoặc đang cho con bú), khỏe mạnh, cân nặng không dưới 2kg. Thỏ được nhốt riêng từng con và nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi sử dụng.
Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhiệt độ phòng 20 – 30oC, độ ẩm tương đối 30 – 70%, ánh sáng đảm bảo 12 giờ tối, 12 giờ sáng hàng ngày.
Chuẩn bị mẫu thử:
Mẫu thử dùng nguyên không pha loãng.
Tiến hành:
Chuẩn bị súc vật: trước ngày thí nghiệm, làm sạch lông thỏ ở vùng lưng đều về hai bên cột sống một khoảng đủ rộng (2,5cm x 2,5cm) để đặt các mẫu thử. Chỉ sử dụng những thỏ có da khỏe mạnh, đồng đều và lành lặn.
Đặt mẫu thử: mẫu được thử trên 03 thỏ, liều chất thử trên mỗi thỏ là 0,5ml. Đặt mẫu thử đã chuẩn bị ở trên lên gạc không gây kích ứng 2,5cm x 2,5cm có độ dày thích hợp rồi đắp lên da. Cố định miếng gạc bằng băng dính không gây kích ứng ít nhất trong 4h. Sau đó bỏ gạc và băng dính, chất thử còn lại được làm sạch với nước cất.
Quan sát và ghi điểm
Quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da đặt chất thử so với da kề bên không đặt chất thử ở các thời điểm 1 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ sau khi làm sạch mẫu thử. Có thể kéo dài hơn thời gian quan sát khi có tổn thương sâu để có thể đánh giá đầy đủ hơn về khả năng hồi phục hoặc không hồi phục của vết thương nhưng không nên quá 14 ngày.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích nguyên liệu chitosan bằng phƣơng pháp FT-IR, FE-SEM, GPC. 3.1.1. Kết quả phân tích FT-IR
Nguyên liệu ban đầu, chitosan (Sigma-Aldrich DD 75%) được xác định cấu trúc của các nhóm bằng phương pháp đo phổ FT-IR
Hình 3.1: Phổ FT-IR của chitosan nguyên liệu.
Kết quả phổ FT – IR của chitosan ban đầu (hình 3.1) với các đỉnh hấp thu như sau: 3417,04 cm-1
tương ứng với dao động của nhóm -NH2 và -OH của chitosan, đỉnh hấp thu 1657,99 cm-1 tương ứng với dao động của nhóm CONH2, đỉnh hấp thu 1598,68 cm-1 tương ứng với dao động của nhóm -NH2. Đỉnh hấp thu 1078,43 cm-1 tương ứng với dao động của nhóm C-O-C.. Hình 3.2 là công thức cấu tạo của chitosan phù hợp với kết quả phân tích FT – IR đã trình bày.
NH2 và -OH
CONH2
-NH2
Hình 3.2: Công thức cấu tạo của chitosan.
3.1.2. Kết quả phân tích GPC
Kết quả GPC phân tử lượng trung bình số: 162kDa, phân tử lượng trung bình khối: 497kDa, phân tử lượng trung bình nhớt: 497kDa, chỉ số đa phân tán: 3,07 ; DI > 2.
Kết quả nhận được cho thấy mẫu chitosan nguyên liệu có độ đa phân tán cao. Phân tử lượng của chitosan ảnh hưởng rất lớn đến kích thước hạt. Thông thường, phân tử lượng của chitosan càng lớn thì kích thước hạt nano chitosan tạo thành càng lớn.
3.1.3. Kết quả phân tích FE-SEM
Hình dạng chitosan ban đầu là từng lớp polymer giống như vảy cá.
3.2. Chế tạo các hạt nano vàng trong chitosan
Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp tổng hợp dung dịch keo nano vàng và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Phương pháp chủ yếu tổng hợp dung dịch nano vàng là phương pháp hóa ướt – là phương pháp từ dưới lên có sự hỗ trợ nhiệt vi sóng. Ưu điểm của phương pháp này là gia nhiệt đồng đều và thời gian thực hiện phản ứng nhanh, kích thước hạt tạo ra đồng đều nhưng khi cần sản xuất lượng lớn thì khá tốn kém. Mặt khác, chất khử thường được sử dụng trong tổng hợp dung dịch nano vàng là NaBH4 – chất khử mạnh, độc và không thân thiện với môi trường. Phương pháp được lựa chọn sử dụng trong đề tài chế tạo nano vàng sử dụng phương pháp gia nhiệt truyền thống. Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra hạt nano đồng đều, có thể chế tạo lượng lớn hạt nano khi cần mà ít tốn kém hơn phương pháp vi sóng. Hóa chất sử dụng trong đề tài là chitosan làm chất ổn định, vitamin C làm chất khử. Đây là chất khử thân thiện với con người. Khi ứng dụng hạt nano vàng vào kem mỹ phẩm, ngoài tính chất diệt khuẩn của hạt nano vàng thì chitosan và vitamin C còn có tác dụng chống lão hóa da. Vitamin C còn dùng làm chất bảo quản trong mỹ phẩm.
Quá trình tổng hợp nano vàng có độ tinh khiết cao do sử dụng tác chất là Chloroauric acid (HAuCl4), tác chất này tương đối bền với không khí, trong môi trường acid acetic và chitosan, ion Au3+
bị khử thành Auo với sự hiện diện của vitamin C, nguyên tử Au tạo thành sẽ kết tụ với nhau tạo hạt nano vàng và được chitosan bao bọc xung quanh ngăn không cho sự va chạm các hạt nano vàng tạo kích thước lớn hơn.
Có thể sử dụng vitamin C làm chất khử vì nhiệt độ phản ứng xảy ra khoảng 80oC nên acid không bị mất tác dụng. Ngoài ra, chitosan và vitamin C không gây độc hại với môi trường và con người nên thích hợp sử dụng trong quy trình tổng hợp xanh.
Hạt nano vàng tạo thành được đem đi kiểm nghiệm ở BỘ Y TẾ - VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC có kết quả không độc hại với người.
Trong phương pháp chế tạo dung dịch keo nano vàng sử dụng tiền chất là acid (HAuCl4) và chitosan có tác dụng là chất bảo vệ, vitamin C là chất khử.
3.2.1. Kết quả UV-Vis, TEM, XRD
Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình chế tạo nano vàng – chitosan
Trong thí nghiệm này, thể tích chitosan 0,5%wt, thể tích vitamin C 10-3M là 5ml, thể tích HAuCl4 10-3M là 6ml được giữ cố định, thời gian khảo sát từ 60 phút đến 300 phút các kết quả được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.5.
Hình 3.4: Mẫu khảo sát ảnh hưởng của thời gian mẫu 1 mẫu 2 mẫu 3 mẫu 4 mẫu 5
Hình 3.5:Phổ UV-Vis của các mẫu dung dịch keo nano vàng – chitosan theo thời gian: Mẫu 1(60’), 2(120’), 3(180’), 4(240’), 5(300’).
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát theo thời gian
Bảng 3.1 và hình 3.5 cho thấy thời gian thực hiện phản ứng càng lâu thì màu của mẫu nano vàng – chitosan càng đậm từ mẫu 1 đến mẫu 5 ứng với thời gian 60 phút đến 300 phút, màu sắc đổi từ màu hồng sang màu đỏ.
Kết quả UV-Vis (hình 3.6) của các mẫu dung dịch nano vàng cho thấy khi tăng thời gian từ 60 – 300 phút thì độ hấp thu tăng. Độ hấp thu tăng chậm từ mẫu 1 đến mẫu 3. Tiếp tục tăng thời gian 240 phút thì độ hấp thu tăng nhanh từ 0,190
toC pH Thể tích acid acetic 1% (ml) Nồng độ chất khử (M) chitosan (g) t (phút) Abs Peak (nm) 80 4,5 50 10-3 0,25 60 0,150 518,5 120 0,158 519 180 0,190 520,5 240 0,237 521 300 0,208 521 521nm
(mẫu 3) đến 0,237 (mẫu 4). Điều này chứng tỏ hạt nano vàng tạo ra trong dụng dịch khá nhiều, hình dạng mũi có tính đối xứng cao. Khi tiếp tục tăng thời gian lên 300 phút thì độ hấp thu bắt đầu giảm từ 0,237 (mẫu 4) xuống 0,208 (mẫu 5). Có lẽ là khi tăng thời gian quá mức giới hạn của phản ứng, các hạt nano sau khi hình thành, chuyển động va chạm tạo thành hạt kích thước lớn hơn làm giảm số lượng hạt nên độ hấp thu giảm. Vậy dựa vào kết quả UV-Vis, với tỷ lệ nHAuCl4:nVitaminC = 6:5, nhiệt độ 80oC, pH = 4.5, thời gian thích hợp để tổng hợp hạt nano vàng là 240 phút.
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nHAuCl4/nvitamin C .
Trong nghiên cứu này, phản ứng được khảo sát khi giữ nguyên thể tích chitosan, thời gian 240 phút, nhiệt độ 80oC, pH=4,5; thay đổi tỷ lệ nHAuCl4/ nvitamin C từ 1:5 đến 11:5, theo bảng 3.2.
Hình 3.6: Các mẫu dung dịch nano vàng – chitosan khi thay đổi tỷ lệ nHAuCl4/nvitamin C.
Hình 3.7: Phổ UV-Vis của các mẫu dung dịch keo nano vàng khảo sát ảnh hưởng nHAuCl4/nvitamin C.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nHAuCl4/nvitamin C.
Theo hình 3.7 khi tăng tỷ lệ nHAuCl4/nvitamin C thì màu của dung dịch nano vàng – chitosam đậm dần. Kết quả UV-Vis (hình 3.8) của các mẫu dung dịch keo nano vàng khi thay đổi tỉ lệ nHAuCl4:nvitaminC (từ 1:5 đến 10:5), (giữ nguyên
Thể tích acid acetic 1% (ml) Nồng độ chất khử (M) m chitosan (g) nHAuCl4/ nVitaminC t (ph) Abs Peak (nm) 50 10-3 0,25 1:5 240 0,067 492 50 10-3 0,25 2:5 240 0,098 518 50 10-3 0,25 3:5 240 0,108 518 50 10-3 0,25 4:5 240 0,131 518 50 10-3 0,25 5:5 240 0,216 518 50 10-3 0,25 6:5 240 0,251 518 50 10-3 0,25 7:5 240 0.268 522 50 10-3 0,25 8:5 240 0,356 522 50 10-3 0,25 9:5 240 0,463 522 50 10-3 0,25 10:5 240 0,687 522 50 10-3 0,25 11:5 240 0,486 523 522 nm
thể tích vitamin C, thay đổi HAuCl4). Trong khoảng tỉ lệ nHAuCl4:nvitaminC từ 1:5 đến 10:5, nhận thấy độ hấp thu quang tăng dần từ 0,067 – 0,687, chứng tỏ sự gia tăng số lượng các hạt nano vàng tạo thành trong dung dịch và được bảo vệ bởi chất bảo vệ chitosan. Tuy nhiên, khi tăng tỉ lệ nHAuCl4:nvitaminC lên 11:5 thì độ hấp thu bắt đầu giảm từ 0,687 xuống 0,486 lúc này do HAuCl4 tăng, chất bảo vệ không đủ để bảo vệ hạt nano vàng tạo thành nên các hạt nano kết tụ lại với nhau để đạt kích thước lớn, số lượng hạt nano vàng tạo ra ít hơn nên độ hấp thu giảm.
Qua thí nghiệm khảo sát các tỉ lệ nHAuCl4: nvitaminC thì tỉ lệ 10:5 là tỉ lệ tốt nhất để chế tạo hạt nano vàng tại nhiệt độ 80oC.
Khảo sát ảnh hưởng của pH.
Ở thí nghiệm này, thể tích chitosan 0,5%wt, thể tích vitamin C 10-3
là 0,5ml, thể tích HAuCl4 10-3 là 10ml được cố định, ta thay đổi pH dung dịch chitosan 0,5%wt từ 4,0 đến 5,0. Các kết quả được trình bày trong bản 3.3, hình 3.9; 3.10.
Hình 3.8: Mẫu khảo sát ảnh hưởng của pH. Ta nhận thấy màu của mẫu đậm dần từ pH 4,0 – 5,0.
Hình 3.9: Phổ UV-Vis của các mẫu dung dịch keo nano vàng khảo sát ảnh hưởng pH.
Bảng 3.3: Khảo sát ảnh hưởng của pH trong quá trình tạo nano vàng
Theo bảng 3.3 và hình 3.10 độ hấp thu tăng theo giá trị pH.
Dựa vào phổ UV-Vis, ta thấy khi pH tăng thì độ hấp thu tăng do hạt nano vàng được tạo ra nhiều. Khi pH = 4,5 có độ hấp thu 0,688; khi tăng pH = 5,0 thì độ hấp thu tăng mạnh từ 0,688 đến 0,903. Có thể giải thích ở pH = 5,0 thích hợp để chitosan tan tốt trong acid acetic 1% và hạt nano tạo ra nhiều, chitosan làm tốt nhiệm vụ là chất bảo vệ. Nếu tiếp tục tăng pH >5 thì chitosan không tan, vón cục lại. Vậy pH tốt nhất để phản ứng xảy ra tối ưu là 5 [22].
toC pH Thể tích dung môi axitacetic 1% (ml) Nồng độ chất khử (M) Khối lượng chitosan (g) Abs Peak (nm) 80 4,0 50 10-3 0,25 0,660 520 80 4,5 50 10-3 0,25 0,687 522 80 5,0 50 10-3 0,25 0,903 524 524
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình hình thành hạt nano trong dung dịch chitosan được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.11 và 3.12.
Hình 3.10: Mẫu khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Hình 3.11: Phổ UV-Vis của các mẫu dung dịch keo nano vàng khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ.
mẫu 1 mẫu 2 mẫu 3 mẫu 4 mẫu 5 mẫu 6 mẫu 7
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành hạt nano vàng trong dung dịch chitosan.
Kết quả UV-Vis các mẫu dung dịch nano vàng cho thấy khi tăng nhiệt từ 30- 90oC thì độ hấp thu tăng rõ. Độ hấp thu tăng chậm ở các mẫu từ 30 – 70oC. Tiếp tục tăng nhiệt độ lên 80oC thì độ hấp thu tăng nhanh từ 0.618 (70oC) đến 0,903 (80o
C), điều này chứng tỏ hạt nano vàng tạo ra trong dụng dịch khá nhiều. Khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 90oC thì độ hấp thu bắt đầu giảm từ 0,903 (80o
C) xuống 0,622 (90oC). Có thể là do khi tăng nhiệt độ quá mức giới hạn của phản ứng, các hạt nano sau khi hình thành, chuyển động va chạm hỗn độn tạo thành hạt kích thước lớn hơn làm giảm số lượng hạt nên độ hấp thu giảm. Vậy dựa vào kết quả UV-Vis, với tỷ lệ nHAuCl4: nvitaminC = 10:5, thời gian phản ứng 240 phút, pH = 4,5, nhiệt độ thích hợp tổng hợp hạt nano vàng là 80oC.
3.3. Kết quả TEM