Tất cả các loại kem đều ở dạng nhũ, thường là nước/dầu hay dầu/nước. Sản phẩm dạng kem phải ổn định trong thời gian dài, không bị phân lớp. Màng kem tạo trên da phải mỏng, đều, mềm mại, có độ mịn, độ bóng và bám tốt trên da. Không gây cảm giác khó chịu và có pH thích hợp với da.
Kem chứa hạt nano vàng sẽ có khả năng chống tàn nhan và lão hóa da. Hạt nano vàng có kích thước nhỏ nên dễ dàng xâm nhập qua lớp biểu bì của da, thấm sâu vào tế bào. Vàng là kim loại âm tính, có tính chống oxy hóa mạnh, vì vậy làm giảm khả năng oxy hóa và các gốc tự do từ bên trong cơ thể. Bên cạnh đó, nano vàng có khả năng diệt khuẩn khá tốt.
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và dụng cụ-thiết bị
2.1.1. Hóa chất
Bảng 2.1: Hóa chất dùng trong nghiên cứu chế tạo nano vàng - chitosan
Tên hóa chất Công thức Hãng sản xuất Thành phần
Chloroauric acid HAuCl4.3H2O Merck 99,0% Chitosan (C12H24N2O9)n Sigma-Aldrich DD 75%
Sodium hydroxide NaOH Merck 96,0%
Acid acetic CH3COOH Merck 99,5%
Vitamin C C6H8O6 Merck 99,7%
Nước cất milyporee H2O Merck 99.9%
- Chloroauric acid (HAuCl4) được sử dụng làm tiền chất để chế tạo các hạt nano vàng.
- Chitosan (DD 75%) được sử dụng làm tác chất để khử muối vàng đồng thời cũng là chất bảo vệ các hạt nano vàng mới được tạo thành.
- Acid acetic được sử dụng để hòa tan chitosan.
- Vitamin C (C6H8O6) được sử dụng làm tác chất khử trong quá trình khử Au3+
về Auo.
- Sodium hydroxide (NaOH) được sử dụng để điều chỉnh độ pH. - H2O được sử dụng trong quá trình pha hóa chất.
Bảng 2.2: Hóa chất dùng trong nghiên cứu chế tạo nền kem. Nền kem Thành phần Khối lượng (g) Tác dụng
Emuldage SE – PE 4,50 Nhũ hóa
Glycerin 3,00 Dung môi
Tướng nước
PEG-150 distearate 3,00 Giữ ẩm
Ethylenediaminetetraacetic acid
0,05 Hoạt động bề
mặt Nước 80,20 (vừa đủ 100ml) Dung môi
Lanolin 0,50 Làm mềm
Cetyl alcohol 1,50 Tác nhân phụ
trợ hóa học Tướng
dầu
Isopropyl myristate 3,00 Bám dính
Glycerin monostearate 1,00 Nhũ hóa, sáp làm mềm
Phenopin 0,25 Bảo quản
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Hình 2.1: Mấy khuấy từ IKA RET control-vis và pipet BIOHIT Proline, Đức. Bercher 100ml, bình định mức 50ml.
Máy khuấy từ IKA RET control-visc, Đức (Phòng Hóa lý ứng dụng, ĐH KHTN, Tp. HCM).
Máy đo pH IQ Scientific Instruments (Bộ môn Hóa phân tích, ĐH KHTN, Tp. HCM).
Máy quang phổ UV-Vis-NIR-V670, JASCO, Nhật (Phòng Hóa lý ứng dụng, ĐH KHTN, Tp. HCM).
Máy TEM, JEM-1400, Nhật (Phòng Thí nghiệm trọng điểm quốc gia về Vật liệu Polyme và Composit, ĐH Bách Khoa, Tp. HCM).
Máy FE-SEM JSM 7401F, Nhật (Phòng thí nghiệm công nghệ nano, Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh).
Máy đo phổ FT-IR BRUKER EQUINOX 55, Đức (Phòng Thí Nghiệm Trung Tâm, ĐH KHTN, Tp. Hồ Chí Minh).
2.2. Nội dung nghiên cứu
Với mục tiêu nghiên cứu và điều chế các hạt nano vàng trong chitosan, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước, và sự phân bố kích thước của các hạt nano nhằm hướng đến chế tạo nano vàng-chitosan ứng dụng trong dược phẩm.
Các nội dung cần nghiên cứu:
- Phân tích đặc điểm nguyên liệu chitosan.
- Khảo sát chế tạo hạt nano vàng trong dung dịch chitosan.
- Khảo sát chế tạo hạt nano vàng trong chitosan với chất khử vitamin C. - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo hạt nano vàng – chitosan. - Tạo nano vàng – chitosan hướng tới ứng dụng trong kem dưỡng da.
- Tạo nền kem và phối nano vàng – chitosan, khảo sát độ ổn định của hệ kem.
2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích đặc điểm nguyên liệu chitosan 2.2.1.1. Phƣơng pháp phân tích FT-IR
Hình 2.2: Máy đo phổ FT- IR BRUKER EQUINOX 55.
Phương pháp FT-IR (Fourrier Transformation InfraRed) hoạt động dựa trên sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại của vật chất cần nghiên cứu. Phương pháp này ghi nhận các dao động đặc trưng của các liên kết hóa học giữa các nguyên tử, và hàm lượng mẫu cần phân tích thấp. Để thu phổ, một lượng nhỏ của chitosan được trộn lẫn với KBr và nén thành dạng viên.
Phổ FT-IR của chitosan được đo bằng máy đo phổ FT-IR BRUKER EQUINOX 55 của Phòng Thí Nghiệm Trung Tâm, ĐH KHTN, Tp. Hồ Chí Minh.
2.2.1.2. Phƣơng pháp đo sắc ký thẩm thấu gel GPC Nguyên lý hoạt động
GPC là một thiết bị sắc ký có thể xác định được khối lượng phân tử của các hợp chất cao phân tử. Hỗn hợp được tách dựa theo kích thước của phân tử các chất phân tích được phân bố khác nhau vào trong các lỗ xốp của pha tĩnh. Các phân tử có kích thước nhỏ sẽ chui sâu bên trong lỗ xốp nên được rửa giải ra sau, và ngược lại.
Khối lượng phân tử của nguyên liệu chitosan được đo trên máy sắc ký thẩm thấu gel-Gel Permeation Chromatography (GPC) AGILENT 1100 Series (hình 2.3) của Phòng Thí Nghiệm Trung Tâm, ĐH KHTN, Thành Phố Hồ Chí Minh.
Hình 2.3: Máy sắc ký thẩm thấu gel GPC AGILENT 1100 Series.
2.2.1.3.Phƣơng pháp chụp ảnh FE-SEM
Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường FE-SEM (hình 2.4) dùng để xác định hình dạng nguyên liệu. Các dạng mẫu đem phân tích có thể là rắn, màng, bột, mẫu dẫn điện hoặc không dẫn điện. Ảnh kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường – Field Emmission Scanning Electron Microscopy (FE-SEM) của nguyên liệu chitosan được chụp bằng máy FE-SEM JSM 740F của Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Nano, Đại Học Quốc Gia Thành Tp. Hồ Chí Minh.
Mẫu được chuẩn bị ở dạng lỏng, được quét trên tấm lam, sau đó chờ cho mẫu đã được quét khô hoàn toàn và đem đi chụp.
2.2.2. Phƣơng pháp chế tạo hạt nano vàng
Phƣơng pháp tổng hợp hợp hạt nano vàng trong chitosan, với chất trợ khử là C6H8O6
Hình 2.5: Qui trình chế tạo hạt nano vàng trong chitosan có vitamin C làm chất khử.
Hình 2.6: (a) Mẫu chứa dung dịch chitosan – vitamin C – HAuCl4 , (b) Mẫu chứa dung dịch nano vàng trong chitosan.
Dung dịch C6H8O6 10-3M
Khuấy từ đến khi tan hoàn toàn Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1M Dung dịch acid acetic 1% Dung dịch chitosan đồng nhất Phân tích phổ UV-Vis Chụp ảnh TEM Chitosan Dung dịch nano vàng trong chitosan Dung dịch HAuCl4.3H2O (a) (b)
Trong quá trình thực hiện quy trình chế tạo dung dịch nano vàng – chitosan, có những thông số cần khảo sát. - Thời gian từ 240 phút đến 300 phút. - pH từ 4,5 đến 5,0. - Tỷ lệ nHAuCl4/nvitamin C từ 1:5 đến 11:5. - Nhiệt độ từ 30oc đến 90o c.
2.2.3. Các phƣơng pháp phân tích hạt nano vàng và màng nano vàng 2.2.3.1. Phƣơng pháp đo phổ hấp thụ bằng máy quang phổ UV-Vis
Quang phổ kế là thiết bị dùng để đo mật độ quang và độ truyền quang. Quang phổ kế UV- Vis hoạt động ở vùng UV-Vis. Máy đo cường độ tia sáng sau khi đi qua mẫu (I1) và so sánh với cường độ ánh sáng tới (IO), từ đó tính ra mật độ quang.
Cấu tạo chính của quang phổ kế gồm: nguồn sáng (thường là đèn nhiệt quang với ánh sáng VIS và đèn hồ quang đetơri cho ánh sáng UV), giá đặt mẫu, bộ lọc ánh sáng hay lưới nhiễu xạ để lọc lấy ánh sáng đơn sắc. Đầu dò thường là diod quang. Diod quang luôn đi kèm bộ lọc ánh sáng để chỉ ánh sáng đến được diod.
Trong quang phổ kế hai chùm tia ánh sáng được chia làm hai tai bằng gương quay trước khi đến mẫu. Một tia được dùng làm so sánh, tia còn lại đi qua mẫu (Hình2.7). Quang phổ kế hai chùm tia có thể có hai hay một đầu dò. Trường hợp hai đầu dò thì tia so sánh và tia mẫu được đo đồng thời như hình 2.7. Với loại một đầu dò thì ở một thời điểm chỉ có một trong hai tia sáng đến được đầu dò, còn tia kia bị chặn lại. Đầu dò lần lượt đo từng tia một.
Quang phổ kế thường đo mẫu ở dạng lỏng, tuy vậy vẫn có thể đo được mẫu khí và thậm chí cả mẫu rắn. Mẫu được chứa trong cuvet (cuvette) hoàn toàn trong suốt (không hấp thu ánh sáng ở vùng khảo cứu). Cuvet có dạng hình hộp chữ nhật, phổ biến nhất có bề dày 1cm (quãng đường l trong định luật Beer – Lambert).
Phổ hấp thu UV-Vis của một dung dịch là một hàm theo nồng độ của tất cả các thành phần có mặt trong dung dịch. Phương pháp này sử dụng một quang phổ kế ghi lại sự khác biệt trong hấp thu giữa mẫu trắng và mẫu kiểm tra để cung cấp phổ cho mẫu. Nó có khả năng ghi lại sự hấp thu trong vùng bước sóng từ 200- 750nm, với độ chính xác ±0,5nm.
Phổ hấp thu UV-Vis của dung dịch chứa các hạt nano vàng trong bài này được đo bởi máy quang phổ UV-Vis-NIR-V670, JASCO (hình 2.9) của Phòng Hóa lý ứng dụng, ĐH KHTN, Tp. HCM.
2.2.3.2. Phƣơng pháp chụp ảnh TEM
Kính hiển vi điện tử truyền qua, Transmission Electron Microscopy (TEM), là một công cụ rất mạnh trong việc nghiên cứu cấu trúc ở cấp độ nano, nó cho phép quan sát chính xác cấu trúc nano với độ phân giải lên đến 0,2nm. Trong nghiên cứu này, các mẫu dung dịch keo vàng được chụp ảnh TEM để xác định kích thước các hạt nano vàng.
Hình 2.9: Máy TEM, JEM-1400, Nhật.
Việc chụp ảnh TEM được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Đại Học quốc gia, Đại học Bách Khoa TP.HCM.
Mẫu dung dịch nano vàng – chitosan đem đi chụp ở dạng lỏng, sau đó được kỹ thuật viên quét mẫu trên lưới đồng đã được chia từng ô. Để khô mẫu đã quét và quét thêm mẫu lên lưới đồng nếu dung dịch cần đo có nồng độ hạt nano thấp.
Nguyên tắc của phương pháp hiển vi điện tử truyền qua: trong phương pháp này, hình ảnh thu được chính là do sự tán xạ của chùm electron xuyên qua mẫu.
Cấu tạo gồm 3 bộ phận chính: hệ thống chiếu sang, hệ thống thấu kính, hệ thống phân tích ảnh (Hình 2.10)
Hình 2.10: Cấu tạo của kính hiển vi điện tử truyền qua.
Hệ thống chiếu sáng bao gồm: súng phóng chùm electron (1), thấu kính tụ quang (2), màng ngăn (3). Hệ thống này có tác dụng chiếu chùm electron lên mẫu (4). Những thấu kính tụ quang sử dụng trường điện từ để tập trung chùm electron.
Chùm electron sẽ bị tán xạ khi đi qua mẫu và đi đến vật kính, những hình ảnh đầu tiên về mẫu được tạo ra trên vật kính này. Bộ phận điều chỉnh độ mở của vật kính (6) sẽ trải chùm electron ra và tạo sự tương phản cho hình ảnh.
Hệ thống phân tích ảnh sử dụng nhiều thấu kính khác nhau bao gồm hai kính (7) và (8) để phóng đại và tập trung hình ảnh lên màn hình hiển thị (9).
2.2.3.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của dung dịch nano vàng
Phƣơng pháp tiến hành
Cho dịch vi khuẩn E. Coli vào các đĩa petri có chứa dung dịch nano vàng – chitosan. Tiến hành mẫu đối chứng tương tự với mẫu không chứa dung dịch nano vàng – chitosan. Sau các khoảng thời gian 5, 10, 15, 20, 24 giờ, mẫu có chứa dung dịch nano vàng này được pha loãng đến 104, 105, 106. Từ mỗi độ pha loãng lấy ra
100μl đem trải lên đĩa môi trường Nutrient Agar. Ủ ở 37o
C trong 24 giờ rồi đếm số khuẩn lạc thu được.
Cách tính kết quả: Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa. Dùng những đĩa có số khuẩn lạc từ 25 – 250 (theo FDA) để tính mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu:
Mi (CFU/ml) = Ai * Di/V (2.1)
Trong đó: Ai là số khuẩn lạc trung bình trong đĩa Di là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình Mi trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
Hiệu suất kháng khuẩn được xác định theo công thức sau
η = ( N1-N2 )/ N1 * 100% (2.2)
Trong đó: N1 là số khuẩn lạc trong đĩa đối chứng.
2.2.4. Phƣơng pháp tạo nền kem.
Hình 2.11: Sơ đồ tạo nền kem.
Bước 1: Lấy 4,5g Emuldage SE-PE, 3g polyethyleneglycol 6000, 0,05g
EDTA trộn với nhau. Sau đó thêm 3g glycerin và nước vào được 100ml dung dịch để được tướng. Khuấy hỗn hợp ở 80oC, 700 vòng/phút để được hỗn hợp đồng nhất.
Bước 2: Lấy 1,5g Cetyl alcohol, 3g isopropyl myristate, 1g glycerin
monostearate, 0.25g phenopin trộn với nhau. Sau đó thêm 0,5g lanolin được tướng dầu. Khuấy hỗn hợp ở 80oC, 700 vòng/phút để được hỗn hợp đồng nhất, trong suốt.
Bước 3: Trộn tướng nước và tướng dầu với nhau, khuấy trong vòng 45 phút.
Sau đó, lấy ra để ổn định ở 40oC thu được nền kem. Phối dung dịch nano vàng vào nền kem, sau đó bảo quản tối. Sản phẩm thu được xác định tính chất hóa lý như kiểm tra độ cứng, khả năng kích ứng da của kem.
Tướng nước Tướng dầu
Nền kem
Tướng dầu gia nhiệt đến 80oC,
khuấy cho tan hoàn toàn (700v/ph)
Tướng nước gia nhiệt 80o
C, khuấy 700v/ph Khuấy 700v/ph, 80oC, 45phút Kiểm tra độ cứng Độ kích ứng da Hàm lượng vàng trong kem
2.2.5. Các phƣơng pháp phân tích mẫu kem nền và kem nano vàng – chitosan. 2.2.5.1. Phƣơng pháp đo độ lún kim.
- Độ lún kim biểu thị độ mềm và độ xốp của kem. - Thực hiện
+ Dùng một kim A cỡ kim lượt dài 13mm đầu nhọn, có trọng lượng = 0.0788g nhưng không quá nhọn, cho rơi tự do qua một ống thủy tinh B hình trụ hai đầu bằng, dài 50cm, đường kính 1cm và được đặt cách hộp kem 1-2cm.
+ Khi kim lún vào kem, nâng ống B lên, rút kim ra và đo độ lún vào kem của kim (tính bằng mm), đo mỗi mẫu 3 lần và lấy trị số trung bình.
Hình 2.12: Phương pháp đo độ lún kim
2.2.5.2. Phƣơng pháp kiểm tra độ độc hại (độ kích ứng da).
Yêu cầu kỹ thuật
Kích ứng da: từ không kích ứng đến kích ứng không đáng kể.
Phương pháp thử Theo ISO 10993 – 10:2002.
Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm:
Cây kim kiểm tra độ lún của kem
Ống thủy tinh thẳng
+ Thiết bị thích hợp để làm sạch lông thỏ. + Bông, gạc và băng keo y tế.
+ Kéo.
Động vật và điều kiện thí nghiệm.
Sử dụng thỏ trắng trưởng thành, đực hoặc cái (không sử dụng thỏ có chữa hoặc đang cho con bú), khỏe mạnh, cân nặng không dưới 2kg. Thỏ được nhốt riêng từng con và nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi sử dụng.
Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhiệt độ phòng 20 – 30oC, độ ẩm tương đối 30 – 70%, ánh sáng đảm bảo 12 giờ tối, 12 giờ sáng hàng ngày.
Chuẩn bị mẫu thử:
Mẫu thử dùng nguyên không pha loãng.
Tiến hành:
Chuẩn bị súc vật: trước ngày thí nghiệm, làm sạch lông thỏ ở vùng lưng đều về hai bên cột sống một khoảng đủ rộng (2,5cm x 2,5cm) để đặt các mẫu thử. Chỉ sử dụng những thỏ có da khỏe mạnh, đồng đều và lành lặn.
Đặt mẫu thử: mẫu được thử trên 03 thỏ, liều chất thử trên mỗi thỏ là 0,5ml. Đặt mẫu thử đã chuẩn bị ở trên lên gạc không gây kích ứng 2,5cm x 2,5cm có độ dày thích hợp rồi đắp lên da. Cố định miếng gạc bằng băng dính không gây kích ứng ít nhất trong 4h. Sau đó bỏ gạc và băng dính, chất thử còn lại được làm sạch với nước cất.
Quan sát và ghi điểm
Quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da đặt chất thử so với da kề bên không đặt chất thử ở các thời điểm 1 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ sau khi làm sạch mẫu thử. Có thể kéo dài hơn thời gian quan sát khi có tổn thương sâu để có thể đánh giá đầy đủ hơn về khả năng hồi phục hoặc không hồi phục của vết thương nhưng không nên quá 14 ngày.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích nguyên liệu chitosan bằng phƣơng pháp FT-IR, FE-SEM, GPC. 3.1.1. Kết quả phân tích FT-IR
Nguyên liệu ban đầu, chitosan (Sigma-Aldrich DD 75%) được xác định cấu trúc của các nhóm bằng phương pháp đo phổ FT-IR
Hình 3.1: Phổ FT-IR của chitosan nguyên liệu.