3.3.1. Thăm dò sự ảnh hƣởng của hàm lƣợng phức
H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O đến sự nảy mầm và phát triển mầm của hạt đậu tƣơng
3.3.1.1. Phƣơng pháp thí nghiệm
Chọn 7 mẫu hạt đỗ tương, mỗi mẫu 50 hạt kích thước tương đối đồng đều (khối lượng 11,87±0,01 g ). Ngâm hạt trong các dung dịch phức chất có nồng độ 60, 120, 180, 240, 300 ppm (mẫu so sánh ngâm trong nước cất). Thể tích các dung dịch phức chất và nước cất đem ngâm là 100 ml. Sau thời gian 24 giờ vớt ra và ủ hạt trong cốc cỡ 500 ml, được lót dưới và đậy trên bằng giấy lọc. Các dung dịch ngâm được thu hồi để tưới lại lần sau. Hàng ngày tưới
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hạt bằng các dung dịch phức và nước cất theo thứ tự các mẫu, ngày tưới 3 lần, mỗi lần 30 phút.
Sau khi mầm hạt phát triển được số ngày tuổi nhất định, chúng tôi tiến hành xác định tỷ lệ nảy mầm của hạt, đo độ dài thân và rễ của từng cây trong các mẫu thí nghiệm. Các thí nghiệm được lặp lại 7 lần.
3.3.1.2. Ảnh hƣởng của phức chất đến sự nảy mầm của hạt đậu tƣơng
Sau khi ủ hạt được một ngày, đếm số hạt nảy mầm từ đó tính tỷ lệ nảy mầm của hạt. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng phức H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O đến sự nảy mầm của hạt đậu tƣơng
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Nồng độ phức chất (ppm) 0(H2O) 60 120 180 240 300
Tỷ lệ nảy mầm (%) 88,33 86,00 78,67 74,40 71,56 67,67
n 7
Nhận xét: Phức chất có tác dụng ức chế sự nảy mầm của hạt đậu tương. Sự ức chế làm giảm tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tương. Sự ức chế rõ rệt ở nồng độ 120 ppm và sự ức chế tăng theo nồng độ.
3.3.1.3. Ảnh hƣởng của phức chất đến sự phát triển mầm của hạt đậu tƣơng
Khi mầm hạt phát triển được 4 ngày tuổi, chúng tôi tiến hành đo chiều cao của mầm và độ dài của rễ.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.8: Ảnh hƣởng của nồng độ phức chất H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O đến sự phát triển mầm của hạt đậu tƣơng
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Nồng độ phức chất (ppm) 0(H2O) 60 120 180 240 300
Thời gian (ngày) 4
d T (cm) 3,07 2,84 2,46 2,27 2,05 1,82 d R (cm) 2,34 2,2 1,78 1,61 1,42 1,25 AT (%) 100 92,51 80,13 73,94 66,78 59,28 AR (%) 100 94,02 76,07 68,80 60,68 53,42 n 7 n : độ lặp lại
d T: là độ dài trung bình của thân mầm đỗ tương
d R : là độ dài trung bình của rễ mầm đỗ tương AT là % độ dài thân so với đối chứng
AR là % độ dài rễ so với đối chứng
AT, AR= SS X d d .100 (%)
d SS: Độ dài trung bình thân, rễ của mầm đỗ tương ở mẫu so sánh
(đối chứng).
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.8: Ảnh hƣởng của nồng độ phức chất H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O đến sự phát triển mầm hạt đậu tƣơng
Mẫu 1 2 3 4 5 6
Nồng độ phức chất (ppm) 0(H2O) 60 120 180 240 300
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.8, hình 3.8 cho thấy phức chất có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt đậu tương. Sự ức chế làm giảm chiều cao của mầm và độ dài của rễ. Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 60 ÷ 300 ppm, phức chất có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt đậu tương. Sự ức chế rõ rệt ở nồng độ 120 ppm và tăng theo nồng độ.
3.3.1.4. So sánh ảnh hƣởng của phức chất, ion kim loại và phối tử đến sự nảy mầm của hạt đậu tƣơng
Để so sánh ảnh hưởng của phức H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O, ion kim loại và phối tử đến sự nảy mầm của hạt đậu tương, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các mẫu :
Mẫu 1: H2O
Mẫu 2: Dung dịch phức H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O nồng độ 120 ppm.
Mẫu 3: Dung dịch muối La3+
nồng độ 120 ppm. Mẫu 4: Dung dịch lơxin nồng độ 360 ppm.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng phức H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O, La3+, và HLeu đến sự nảy mầm của hạt đậu tƣơng
STT 1 2 3 4
Mẫu H2O H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O La3+ HLeu
Nồng độ (ppm) 0 120 120 360
Tỷ lệ nảy mầm(%) 88,33 78,67 82,57 70,84
Nhận xét: Cũng như phức chất, phối tử và ion trung tâm có tác dụng ức chế sự nảy mầm của hạt đậu tương. Phức chất có tác dụng ức chế kém hơn phối tử và tốt hơn ion trung tâm.
3.3.1.5. So sánh ảnh hƣởng của phức chất, ion kim loại và phối tử đến sự phát triển mầm của hạt đậu tƣơng
Khi mầm hạt phát triển được 4 ngày tuổi (ở thí nghiệm 3.3.1.4), chúng tôi tiến hành đo chiều cao của mầm và độ dài của rễ.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.10, hình 3.9
Bảng 3.10: Kết quả so sánh ảnh hƣởng của phức H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O, La3+ và HLeu đến sự phát triển mầm của hạt đậu tƣơng
Mẫu 1 2 3 4
Dung dịch H2O H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O La3+ HLeu
Nồng độ (ppm) 0 120 120 360
Thời gian (ngày) 4
d T (cm) 3,07 2,46 2,68 2,31
d R (cm) 2,34 1,78 1,94 1,63
AT (%) 100 80,13 87,30 75,24
AR (%) 100 76,07 82,91 69,66
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9: Ảnh hƣởng của phức H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O, La3+ và HLeu đến sự phát triển mầm của hạt đậu tƣơng
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.10, hình 3.9 cho thấy cũng như phức chất, phối tử và ion kim loại có tác dụng ức chế sự phát triển mầm của hạt đậu tương. Phức chất có tác dụng ức chế kém hơn phối tử và tốt hơn ion kim loại.
3.3.2. Thăm dò sự ảnh hƣởng của phức chất đến một số chỉ tiêu sinh hóa có trong mầm hạt đậu tƣơng
- Phương pháp thí nghiệm: Cân mỗi mẫu 3 gam cây giá đậu tương nghiền bằng cối chày sứ, thêm vào 50 ml dung dịch đệm photphat có pH = 6. Trộn đều, sau đó lọc và li tâm, lấy phần dịch trong. Dịch này đem xác định một số chỉ tiêu sinh hóa: protein và proteaza.
- Để xác định một số chỉ tiêu sinh hóa : protein theo phương pháp Lowry, hoạt độ proteaza theo phương pháp Anson cải tiến, chúng tôi tiến hành xây dựng các đường chuẩn:
* Xây dựng đường chuẩn xác định protein: Dùng ống hút lấy 0,1 ÷ 0,5 ml dung dịch protein huyết thanh bò (0,5 mg/ml) cho vào 5 ống nghiệm đánh số
từ 1 đến 5. Cho vào mỗi ống 5 ml dung dịch D (gồm 48 ml dung dịch Na2CO3
2% trong NaOH 0,1N, 1 ml dung dịch CuSO4 0,5% và 1ml dung dịch NaKC4H4O6 1%), thêm nước cất đến cùng thể tích là 9 ml. Lắc đều, để yên
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
15 phút, bổ sung vào mỗi ống 1 ml dung dịch E (thuốc thử Folin-Ciocalto pha loãng với nước cất tỉ lệ 1:1), lại lắc đều và để yên 30 phút.
Mẫu so sánh không có protein: 5 ml dung dịch D, 4 ml nước và 1 ml dung dịch E. Đo mật độ quang A của các dung dịch ở bước sóng 750 nm [5]. Kết quả được trình bày ở bảng 3.11, hình 3.10.
Bảng 3.11: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào khối lƣợng protein
Mẫu 1 2 3 4 5
Khối lượng protein
(huyết thanh bò) (mg) 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 A750 0,0601 0,0986 0,1331 0,1821 0,2153 y = 0.7878x + 0.0197 R2 = 0.9968 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 mg protein M ật độ qu ang Hình 3.10: Đƣờng chuẩn xác định protein
* Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt độ proteaza: Dùng ống hút lấy những thể tích xác định dung dịch chuẩn tyrosin 1μmol/ml cho vào các bình định mức cỡ 25 ml. Dùng dung dịch HCl 0,2N pha loãng đến vạch để được các dung dịch tyrosin có nồng độ 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 μmol/ml. Lấy 1 ml ở mỗi ống nghiệm trên cho vào 5 ống nghiệm có đánh số thứ tự,
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
thêm vào mỗi ống 4 ml dung dịch Na2CO3 6%. Lắc đều, thêm vào 1ml thuốc
thử Folin-Ciocalteu đã pha loãng 5 lần, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Mẫu so sánh không có tyrosin: 1 ml nước cất, 4 ml dung dịch Na2CO3
6% và 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu.
Đo mật độ quang của các dung dịch ở bước sóng 750 nm [5]. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12, hình 3.11
Bảng 3.12: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ tyrosin
Mẫu 1 2 3 4 5 Tyrosin (μmol/ml) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 A750 0,1901 0,3962 0,5951 0,7798 0,9288 y = 9.305x + 0.0197 R2 = 0.9964 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 mol tyrosin M ật độ qu ang μ Hình 3.11: Đƣờng chuẩn xác định proteaza
3.3.2.1. Ảnh hƣởng của phức chất đến protein của mầm hạt đậu tƣơng
Lấy mỗi mẫu 0,2 ml dịch chiết cho vào các ống nghiệm có đánh số, thêm vào mỗi ống nghiệm 5 ml dung dịch D, bổ sung thêm nước cất đến cùng thể tích 9 ml, lắc đều, để yên 15 phút. Sau đó lại thêm vào mỗi ống 1 ml dung dịch E, lắc đều và tiếp tục để yên 30 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Mẫu so sánh không có dịch chiết: 5 ml dung dịch D, 4 ml nước và 1 ml dung dịch E.
Đo mật độ quang của các mẫu thí nghiệm ở bước sóng 750 nm. Đối chiếu với đường chuẩn protein, tính số mg protein có trong mỗi mẫu.
Hàm lượng protein được tính theo công thức :
X= 100%
m HSPL a
Trong đó:
X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô) a: Nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml) HSPL: Hệ số pha loãng
m: Khối lượng mẫu (mg).
Kết quả phân tích hàm lượng protein của hạt đậu tương khi tác động phức chất H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O (dựa theo công thức và đường chuẩn hình 3.10) được trình bày ở bảng số 3.13.
Bảng 3.13: Ảnh hƣởng của phức chất H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O đến hàm lƣợng protein của mầm hạt đậu tƣơng
Nồng độ phức (ppm) Hàm lượng protein (%) % so với đối chứng
0 27,05 100 60 28,13 103,99 120 29,57 109,32 180 30,48 112,68 240 31,19 115,30 300 31,67 117,08
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Qua bảng 3.13 thấy rằng: Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 60 ppm đến 300 ppm, phức chất H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O có tác dụng làm tăng hàm lượng protein. Hàm lượng protein tăng theo nồng độ.
3.3.2.2. Ảnh hƣởng của phức chất đến hoạt độ proteaza của mầm hạt đậu tƣơng
Cho vào mỗi ống nghiệm có đánh số thứ tự 2 ml tyrosin, 1 ml dịch chiết của từng mẫu, lắc đều, để yên ở 300C trong 10 phút. Thêm vào mỗi ống 5 ml axit tricloaxetic, lắc đều, tiếp tục giữ ở 300
C trong 30 phút.
Mẫu kiểm tra làm tương tự như trên nhưng cho dung dịch axit tricloaxetic vào trước. Mẫu so sánh thay 2 ml tyrosin bằng nước cất.
Cho vào các ống nghiệm khác 1 ml dung dịch lọc của mỗi mẫu thí nghiệm, mẫu kiểm tra và mẫu so sánh, thêm vào mỗi ống 4 ml dung dịch Na2CO3 6% và 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalto đã pha loãng 5 lần, lắc đều và giữ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Đo mật độ quang của các mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra ở bước sóng 750 nm. Lấy hiệu số giá trị mật độ quang giữa mẫu kiểm tra và mẫu thí nghiệm. Dựa vào đồ thị chuẩn proteaza tính lượng μmol tyrosin tương ứng. Từ đó tính đơn vị hoạt độ của proteaza.
Hoạt độ proteaza được tính theo công thức: ĐVHĐ/mg = m T HSPL k n ) ( Trong đó:
n: Số đo trên máy ống thí nghiệm (mg/ml) k: Số đo trên máy ống kiểm tra (mg/ml) HSPL: Hệ số pha loãng
T: Thời gian ủ enzim với cơ chất m: Khối lượng mẫu (mg)
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả phân tích hàm lượng proteaza của hạt đậu tương khi tác động phức chất H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O (dựa theo công thức và đường chuẩn hình 3.11) được trình bày ở bảng số 3.14.
Bảng 3.14: Ảnh hƣởng của phức chất H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O đến hàm lƣợng proteaza của mầm hạt đậu tƣơng
Nồng độ phức chất (ppm) Đơn vị hoạt độ (mg/ml) % so với đối chứng 0 0,510 100 60 0,526 103,14 120 0,551 108,04 180 0,566 110,98 240 0,581 113,92 300 0,589 115,49
Qua bảng 3.14 thấy rằng: Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 60 ppm đến 300 ppm, phức chất H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O có tác dụng làm tăng hàm lượng proteaza. Hàm lượng proteaza tăng theo nồng độ.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN
1. Đã tổng hợp được các phức rắn của La, Eu, Gd với L-lơxin theo tỷ lệ 1:3 về số mol trong điều kiện sau:
+ Môi trường phản ứng pH = 6 ÷ 6,5. + Nhiệt độ phản ứng và cô cạn: 50 ÷ 600
C.
2. Bằng các phương pháp phân tích nguyên tố, phân tích nhiệt, phổ hấp thụ hồng ngoại, đo độ dẫn điện, chúng tôi đi đến kết luận:
+ Các phức chất tổng hợp được có thành phần là
H3[Ln(Leu)3(NO3)3].nH2O (Ln: La, Eu, Gd; n = 3 hoặc 4). + Dung dịch của các phức chất là dung dịch điện li.
+ Mỗi phân tử L-lơxin chiếm 2 vị trí phối trí trong phức chất, liên kết với các ion Ln3+
qua nguyên tử nitơ của nhóm amin (-NH2) và qua nguyên
tử oxi của nhóm cacboxyl (-COO-
).
3. Bước đầu thăm dò ảnh hưởng của phức H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O (nồng độ khảo sát 60÷300 ppm) đến sự nảy mầm, phát triển mầm của hạt đậu tương và hai chỉ tiêu sinh hóa: protein và proteaza của mầm hạt đậu tương, chúng tôi đi đến kết luận:
+ Phức chất H3[La(Leu)3(NO3)3].4H2O có tác dụng ức chế sự nảy mầm và phát triển mầm của hạt đậu tương, sự ức chế tăng theo nồng độ. Phức chất có tác dụng ức chế kém hơn phối tử và tốt hơn ion trung tâm.
+ Phức chất làm tăng hai chỉ tiêu sinh hóa protein và proteaza có trong mầm hạt đậu tương.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Acmetop (1976), Hóa vô cơ, tập II, NXB ĐH và THCN, Hà Nội.
2. Nguyễn Duy Ái, Nguyễn Tinh Dung, Trần Thành Huế, Trần Quốc Sơn, Nguyễn Văn Tòng (2001), Một số vấn đề chọn lọc của hóa học, tập 3, NXB Giáo dục, Hà Nội.
3. Nguyễn Trọng Biểu, Từ Văn Mặc (1978), Thuốc thử hữu cơ, NXB Khoa
học và Kỹ thuật.
4. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1972), Hóa sinh học, NXB Giáo dục,
Hà Nội.
5. Nguyễn Lân Dũng , Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình
Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Tý (1978), Một số phương pháp
nghiên cứu vi sinh vật học, tập III, NXB KH và KT, Hà Nội.
6. Trần Thị Đà, Nguyễn Hữu Đĩnh (2007), Phức chất-phương pháp tổng hợp
và nghiên cứu cấu trúc, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
7. Vũ Thị Anh Đào (2009), Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của một số giống đậu tương (Glycine Max (L.) merrill) địa phương, luận văn thạc sỹ sinh học, Đại học sư phạm Thái Nguyên.
8. Glinka F.B (1981), Hóa học phức chất, Lê Chí Kiên dịch, NXBGD,
Hà Nội.
9. Trần Ích (1978), Hóa sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội, Tr. 12-20.
10. Lê Chí Kiên (1975), Giáo trình hóa học phức chất, tập 2, trường ĐHTH
Hà Nội.
11. Koroxotelev P. P (1974), Chuẩn bị dung dịch cho phân tích hóa học, NXB KH & KT, Hà Nội.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12. Đặng Vũ Minh, Lưu Minh Đại (1995), “Nghiên cứu thử nghiệm phân vi
lượng đất hiếm cho cây lúa”, Tuyển tập báo cáo khoa học, Viện Khoa học
vật liệu, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Hà Nội.
13. Hoàng Nhâm (2003), hóa học vô cơ, tập 3, NXB Giáo dục.
14. Hồ Viết Quý (2005), Các phương pháp phân tích công cụ trong Hóa học
hiện đại, NXB ĐHSP.