3. Nội dung nghiên cứu
3.2. TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB5
Sau khi thu nhận đƣợc gen GmDREB5 bằng PCR, sản phẩm PCR tinh
sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5 và tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng LB agar có bổ sung Kanamycin và X- gal, để qua đêm. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3.
Khi trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc xanh và trắng, lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong LB lỏng có bổ sung đƣợc bổ sung ampicillin, để qua đêm. Tế bào tái tổ hợp đƣợc thu lại bằng cách li tâm và tách chiết plasmid tái tổ hợp.
Sau khi biến nạp và chọn dòng đã đƣợc thực hiện tốt, phản ứng PCR đã đạt mức tối ƣu, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách plasmid theo bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Sản phẩm tách plasmid đƣợc
Hình 3.3. Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng DH5 chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB5
kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid mang gen GmDREB5 của hai
giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Plasmid mang gen GmDREB5
Kết quả điện di trên hình 3.4 cho thấy, sản phẩm tách dòng gen và plasmid đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng. Những mẫu có vạch tƣơng ứng với vị trí 920 bp thì có thể sử dụng để đọc trình tự.
Để xác định trình tự nucleotide của gen GmDREB5 đã tách dòng,
chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen GmDREB5 trên máy đọc
trình tự tự động ABI- 3130 DNA capillary electrophoresis system.
Kết quả đọc trình tự đƣợc đem phân tích bằng phần mềm BioEdit. Kết quả cho thấy chiều dài gen GmDREB5 ở hai mẫu nghiên cứu có kích thƣớc 924 nucleotide. Khi so sánh trình tự này trong Ngân hàng gen quốc tế, kết quả đã xác nhận đây là trình tự gen mã hoá protein DREB5 của cây đậu tƣơng.
Thẳng Xoắn Siêu xoắn
Chúng tôi kết luận đã nhân, tách dòng thành công và xác định trình tự
đƣợc đoạn gen GmDREB5 của giống đậu tƣơng XLS và LBG.
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5
phân lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS, kết quả so sánh đƣợc trình bày ở hình 3.5.
Hình 3.5. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS
Khi so sánh trình tự gen GmDREB5 của 2 giống LBG và XLS, chúng tôi nhận thấy có sự sai khác ở 73 vị trí nucleotide (28, 37, 40, 43, 54, 58, 80, 83, 111, 129, 139, 141, 157, 165, 174, 177, 183, 227, 264, 270, 294, 296, 308, 333, 357, 453, 467, 483, 486, 489, 498, 508, 529, 533, 547, 564, 573, 589, 598, 601, 602, 609, 622, 624, 639, 642, 648, 651, 663, 672, 678, 681, 683, 686, 691, 696, 698, 711, 724, 747, 779, 788, 865, 867, 868, 897, 907, 909, 922, 934, 936, 938, 939).
Kết quả cho thấy, hệ số đồng dạng về trình tự gen GmDREB5 của 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS tƣơng đối cao, đạt 91,7 %.
3.3. SO SÁNH TRÌNH GEN GmDREB5, TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA PROTEIN DREB5 Ở HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG XLS VÀ LBG VỚI CÁC TRÌNH TỰ ĐÃ CÔNG BỐ
3.3.1. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 của hai giống đậu tƣơng XLS và các trình tự đã công bố
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5
phân lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS với 6 trình tự nucleotide của gen GmDREB5 đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI) có các mã số: EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS với 6 trình tự nucleotide của gen
Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân lập từ hai
giống đậu tƣơng LBG và XLS với sáu trình tự nucleotide của gen GmDREB5
đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế cho thấy: Trình tự nucleotide của gen
GmDREB5 của 2 giống LBG và XLS có một số sai khác với cả 6 trình tự nucleotide phân lập từ đậu tƣơng đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568 tại một số vị trí nucleotide.
Kết quả xác định hệ số tƣơng đồng và khoảng cách di truyền về gen
GmDREB5 của 8 giống đậu tƣơng LBG, XLS, EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568 đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác của trình tự gen GmDREB5
của 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS với trình tự gen GmDREB5 của 6 giống đậu tƣơng trên ngân hàng gen quốc tế
Kết quả cho thấy, hệ số đồng dạng về trình tự gen GmDREB5 của 8 giống đậu tƣơng là rất cao, dao động từ 91,6 % đến 99,7 %. Độ tƣơng đồng
giữa 6 trình tự gen GmDREB5 đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế thấp nhất là 91,9 % và cao nhất là 99,7 %.
Gen GmDREB5 của giống đậu tƣơng LBG có độ tƣơng đồng so với các giống có mã số EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568 lần lƣợt là 92,5 %, 98,8 %, 99,7 %, 92,3%, 98,9 %, 92,1 %. Gen
GmDREB5 của giống đậu tƣơng XLS có độ tƣơng đồng so với các giống có mã số EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568 lần lƣợt là 98,9 %; 92,9 %; 92,1 %; 99,4 %; 91,6 %; 99,7 %.
Mối quan hệ di truyền của 8 giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích gen
GmDREB5 đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình cây trên hình 3.7.
Nucleotide Subs titutions (x100) 0 3.7 2 BG.s eq HE598783.s eq HE647690.s eq FR822737.s e q LS.s eq HE648568.s eq HE648567.s eq EF583447.s eq
Hình 3.7. Biểu đồ hình cây so sánh mức độ tƣơng đồng gen GmDREB5
của 8 giống đậu tƣơng
Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 8 giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự gen GmDREB5, kết quả phân tích cho thấy 8 giống đậu tƣơng đƣợc phân thành 2 nhóm chính:
Nhóm I gồm 4 giống, phân thành 2 nhóm phụ: Nhóm phụ 1 gồm 3 giống LBG, HE598783 và HE647690. Nhóm phụ 2 gồm 1 giống FR822737. Nhóm phụ 1 lại chia thành 2 nhóm nhỏ: Nhóm nhỏ 1 gồm 2 giống là LBG và HE598783, nhóm nhỏ 2 gồm 1 giống HE647690.
Nhóm II gồm 4 giống, phân thành 2 nhóm phụ: Nhóm phụ 1 gồm 3 giống XLS, HE648567 và HE648568. Nhóm phụ 2 gồm 1 giống EF583447. Nhóm phụ 1 lại chia thành 2 nhóm nhỏ: Nhóm nhỏ 1 gồm 2 giống XLS, HE648568 và nhóm phụ 2 gồm 1 giống là HE648567.
Nhƣ vậy, 2 giống đậu tƣơng mà chúng tôi nghiên cứu không thuộc cùng một nhóm phụ. Giống đậu tƣơng LBG cùng nhóm phụ với các giống đậu tƣơng có mã số HE598783 và HE647690, FR822737 và HE647690. Đây là các giống chịu hạn kém. Giống đậu tƣơng XLS cùng nhóm phụ với các giống đậu tƣơng có mã số HE648567, HE648568 và EF583447. Đây là các giống chịu hạn tốt.
3.3.2. So sánh trình tự amino acid của protein DREB5 của hai giống đậu tƣơng XLS và các trình tự đã công bố
Gen GmDREB5 phân lập từ 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS có kích thƣớc 924 bp với tất cả trình tự là vùng mã hoá. Chúng tôi tiến hành so sánh
trình tự amino acid trong chuỗi polypeptide do gen GmDREB5 mã hoá của 2
Hình 3.8. So sánh trình tự amino acid mã hoá bởi gen DREB5 phân lập từ 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS
Khi so sánh trình tự amino acid của protein DREB5 ở 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS, chúng tôi thấy có sự sai khác ở 39 vị trí amino acid (10, 13, 14, 15, 20, 27, 28, 47, 53, 55, 63, 76, 98, 99, 103, 156, 170, 181, 183, 197, 200, 202, 203, 208, 225, 227, 228, 229, 231, 233, 242, 260, 263, 289, 290, 297, 303, 312, 313).
Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự amino acid trong chuỗi
polypeptide do gen GmDREB5 mã hoá của 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS
với trình tự amino acid trong chuỗi polypeptide của 6 giống đậu tƣơng đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế (có các mã số: EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568). Kết quả so sánh thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9. So sánh trình tự amino acid mã hoá bởi gen GmDREB5
phân lập từ 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS với trình tự amino acid mã hoá bởi gen GmDREB5 của 6 giống đậu tƣơng đã công bố trên ngân hàng
gen quốc tế
So sánh trình tự amino acid của 8 giống đậu tƣơng cho thấy có sự tƣơng đồng cao (86,7 %- 99,0 %).
Trong đó, trình tự amino acid của giống LBG so với giống EF583447 sai khác ở 46 vị trí, sai khác so với giống FR822737 ở 8 vị trí, sai khác so với giống HE598783 ở 3 vị trí, sai khác so với giống HE648567 ở 49 vị trí, sai khác so với giống HE647690 ở 7 vị trí và sai khác so với giống HE648568 ở 49 vị trí.
Protein DREB5 của giống đậu tƣơng LBG có độ tƣơng đồng so với giống XLS và các giống có mã số EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568 lần lƣợt là 86,7 %; 88,4 %; 97,4 %; 99,0 %; 87,7 %; 97,7 %; 87,7 %.
Trình tự amino acid của giống XLS so với giống EF583447 sai khác ở 5 vị trí, sai khác so với giống FR822737 ở 45 vị trí, sai khác so với giống HE598783 ở 49 vị trí, sai khác so với giống HE648567 ở 3 vị trí, sai khác so với giống HE647690 ở 53 vị trí và sai khác so với giống HE648568 ở 3 vị trí.
Protein DREB5 của giống đậu tƣơng XLS có độ tƣơng đồng so với các giống có mã số EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568 lần lƣợt là 98 %; 89,4 %; 87,7 %; 98,7 %; 86,7 %; 99,0 %.
Kết quả xác định hệ số tƣơng đồng và khoảng cách di truyền về Protein DREB5 của 8 giống đậu tƣơng LBG, XLS, EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568 đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác của trình tự amino acid của Protein DREB5 của 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS với trình tự amino acid của Protein DREB5 của 6 giống đậu tƣơng công bố trên ngân hàng
gen quốc tế
Mối quan hệ di truyền của 8 giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự amino acid của protein DREB5 đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình cây (hình 3.10).
Nucleotide Su bs titution s (x100 ) 0 6.1 2 4 6 BG.aa.p ro
HE5987 83.a a.p ro HE6476 90.a a.p ro FR8227 37.aa.p ro LS.aa.pro
HE6485 68.a a.p ro HE6485 67.a a.p ro EF583 447.pro
Hình 3.10. Biểu đồ hình cây so sánh mức độ tƣơng đồng Protein DREB5 của 8 giống đậu tƣơng
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Đã nhân bản, tách dòng thành công và xác định trình tự gen GmDREB5
phân lập từ hai giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang. Gen
GmDREB5 có kích thƣớc 924 bp mã hóa 307 amino acid.
1.2. Có sự sai khác ở 73 vị trí trong trình tự nucleotide của gen GmDREB5 và 39 vị trí trong trình tự amino acid của protein DREB5 giữa hai giống đậu tƣơng Xuân Lạng Sơn và Lơ Bắc Giang.
1.3. Trình tự nucleotide gen GmDREB5 của giống đậu tƣơng XLS, LBG và các trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI) có hệ số sai khác từ 0,3% đến 8,4%.
1.4. Trình tự amino acid của protein DREB5 của giống đậu tƣơng LBG, XLS và các trình tự đã công bố có hệ số sai khác từ 1% đến 13,3%.
2. Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu trình tự gen DREB5 làm cơ sở cho việc thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc DREB5 phục vụ chuyển gen để cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thi Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình cao học Nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Lê Trần Bình, Võ Thị Ngọc Diệp, Lê Thị Muội (1995), “Nghiên cứu khả năng chịu lạnh và chịu khô ở mô sẹo lúa của các giống lúa có nguồn gốc sinh thái khác nhau”, Tạp chí sinh học, 17(1).
3. Ngô Thế Dân và cộng sự (1999), Cây đậu tương, Nxb Nông Nghiệp.
4. Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở
Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
5. Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.
6. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong
chọn giống cây trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên.
Tài liệu tiếng Anh
7. Abdul B., Frinch R. P., Cocking E. C. (1999), “ Plant regeneration from protoplast of wild rice (Oryza rufipogon Griff)”, Plant cell Rep, 10, pp. 200- 203.
8. Adkins S. M., Shiraishi T., Kunavuvatchaidach R., Godwin I. D. (1995), “Somaclonal varition in rice drought- tolerance and other agronomic characters”, Aust J Bot, 4: 201- 209.
9. Alonso JM, Stepanove AN, Leisse TJ, et al. 2003. Genome- wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science 301, 653- 657. 10. Barrett AJ, Rawlings ND, Davies ME, Machleidt W, Salvesen G, Turk V
(1986), Cysteine proteinase inhibitor of the cystatin superfamily. In: A.J. Barrett, G. Salvesen (Eds.), Proteinase Inhibitors. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, 519- 569.
11. Borbani O, Zhu J, Verslues PE, Sunkar R, and Zhu JK. (2005), Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis- antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis. Cell 123: 1279- 1291.
12. Cao Xin-You., You-Zhi M., (2008), Isolation and Identification of a GmGβ1 Interacting Protein with GmDREB5 Protein in Soybean
(Glycine max), Acta agronomica sinica, 34 (10), pp. 1688−1695.
13. Carleton KL and Kocher TD (2001), Cone opsin genes of African cichlid fishes: tuning spectral sensitivity by differential gene expression. Mol Bio Evol 18: 1540- 1550.
14. Elliott RC, Betzner AS, Huttner E, Oakes MP, Tucker WQ Gerntes D, Perez P, Smyth DR 1996. AINTEGUMENTA, an APETALA2- like gene of Arabidopsis with pleiotropic role in ovule development and floral organ growth. P The Plant Cell 8, 155- 168.
15. Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M. M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., (2005), AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis, Plant Cel, 17(12), pp. 3470-88.
16. Gaiyun Zhang, Ming Chen, Xueping Chen, Zhaoshi Xu, Shan Guan, Lian- Cheng Li, Aili Li, Jiaming Guo, Long Mao and Youzhi Ma. 2008. Phylogeny, gene structures, and expression patterns of the ERF gene family in soybean (Glycine max. L).
17. Gaiyun Zhang, Ming Chen, Liancheng Li, Zhaoshi Xu, Xueping Chen, JiamingGuo and Youzhi Ma, (2009), Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco ,
18. Hartl F.U (1996), Moleculer chaperones in cellular protein folding, Nature, 381, pp. 571- 580.
19. Huang B (2006), Plant- environment interactions, Third edition, Spinger, 15- 40.
20. Liao Y., Zou H.F., Wang H.W., Zhang W.K., Ma B., Zhang J.S., Chen S.Y., (2008), Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants, Cell Res,
18(10), pp. 1047–1060.
21. Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y., (2005), Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses, Theor Appl Genet, 110(8), pp. 1355-62.
22. Lin R., Zhao W., Meng X., Wang M., Peng Y., (2007), Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea, Plant Sci, 172 (1), pp.
120-130.
23. Lei T., Wang Q.Y., Zhai Y., Wang Y., Li J.W., Yan F., Su L.T., (2011), Characterization of a GmHSP70 Gene in Soybean, NCBI, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
24. Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein I (ltp 1) mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AY300806.
25. Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein II (ltp 2) mRNA, complete cds, EMBL Gen Bank, Accession AY300807.
26. Mukai T., Sakaki T., Akiyama T., 2003, Oryza sativa (japonica cultivar-group) lipid transfer protein-like protein (LTP2) mRNA, complete cds, Accession AY466109.
27. Nakano T, Suzuki K, Fujimura T, Shinshi H (2006), genome wide analysis of the ERF gene family in Arabidopsis and rice. Plant Physiology 140, 411- 432.
28. Nguyen H.T.T., Chu M.H., Le S.V., Nguyen C.H., Chu H.H., 2009,