PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3. Nội dung nghiên cứu

2.3.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử

2.3.1.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Tách DNA tổng số đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: - Lấy 200 mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.

- Thêm 0,8 ml đệm rửa, li tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi (lặp lại bƣớc này 2 lần).

- Bổ sung 700 μl đệm tách, trộn nhẹ.

Ủ ở 65оC trong thời gian 1h, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

- Thêm 600 μl chloroform: isoamyl (24:1), dùng máy trộn trộn đều khoảng 20 phút.

- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.

- Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.

- Thêm isopropal, trộn nhẹ đặt nên đá (để trong 1h), chờ đến khi xuất hiện tủa trắng.

- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Thêm 300 μl cồn 70%, búng nhẹ.

- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ cồn (bƣớc này lặp lại 2 lần).

- Làm khô DNA bằng máy speed vac hoặc để trong box vô trùng khoảng 15- 20 phút.

- Hòa tan DNA trong 30 μl nƣớc tinh khiết (nƣớc đã đƣợc ủ ấm ở 60о trong thời gian 10 phút). Lắc đều để DNA hòa tan hoàn toàn.

*) Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phƣơng pháp:

(1) Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 260nm và 280nm. Nồng độ DNA trong dung dịch tách chiết đƣợc tính theo công thức:

Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng.

Độ sạch của DNA đƣợc xác định bằng tỷ lệ A260/A280. Dung dịch chứa DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 đƣợc coi là đảm bảo chất lƣợng.

(2) Phƣơng pháp điện di: Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8 %- 1 %. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi bản gel trên máy soi gen tia UV và chụp ảnh. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.

2.3.1.2. Kỹ thuật PCR

Sau khi đã tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, tiến hành nhân gen DREB5 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi nhân gen DREB5

Mồi Trình tự mồi (5’-3’)

SoyDreb5F ATGCAATTCCCTCACCAATT SoyDreb5R TCAATCCTGATCCTTCCACA

Thành phần, chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.4 và bảng 2.5.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion khử trùng 11 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (2,5 mM) 2,0 5 Mồi xuôi (10 pM/µl) 2,0 6 Mồi ngƣợc (10 pM/µl) 2,0

7 Taq-polymerase (5U/1µl) 1

8 DNA mẫu 2

Tổng 25

Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

1 Biến tính 94 3 phút 1

2 Biến tính 94 1 phút

30

3 Gắn mồi 53 1 phút

4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây

5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1

6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nhuộm bản gel trong ethydium bromid 10 phút, rửa lại bằng nƣớc với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.

2.3.1.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Sau khi nhân đƣợc gen DREB5, bƣớc tiếp theo cần thu nhận gen ở dạng

tinh sạch và không lẫn gel agarose. Vì vậy, cần phải tiến hành thôi gel.

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch (thôi gel) theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas theo các bƣớc nhƣ sau:

- Cắt lấy bản điện di có kích thƣớc khoảng 924 bp trên bản gel agarose cho vào ống eppendorf 1,5 ml.

- Bổ sung 1000 μl dung dịch Binding solution.

- Ủ ở 55оC trong khoảng 20 phút, 5 phút trộn nhẹ một lần cho gel tan hoàn toàn thành dịch trong suốt.

- Bổ sung 5-10μl Silica power suspension vào và ủ hỗn hợp ở 55оC khoảng 5

phút. Trộn và lắc đều khoảng 2 phút.

- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nồi, thu cặn màu trắng. - Thêm 500μl buffer wash. Lắc đều trong 2 phút. Li tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nồi, thu cặn (lặp lại 3 lần).

- Hút dịch nổi bằng pipetman. - Làm khô DNA trong box.

- Hòa tan DNA trong 20μl H2O detion khử trùng rồi ủ sản phẩm ở 55оC trong 5- 10 phút.

- Li tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút để thu dịch nổi, bỏ tủa.

Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.

2.3.1.4. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng

Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT.

Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT

Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT đƣợc thể hiện ở bảng 2.6.

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòngpBT

STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion khử trùng 12,2 2 DNA 4 3 Ligation buffer 10X 2 4 Vector pBT 1 5 Enzyme T4 ligase 0,8 Tổng 20

Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 1h, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.

2.3.1.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Hỗn hợp đƣợc ủ ở 22оC trong 1h, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Bổ sung 7 μl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ.

- Đặt hỗn hợp vào đá trong 30 phút sau đó ủ ở 42о trong 1 phút. Tiếp tục đặt hỗn hợp trên vào đá trong 5 phút.

- Bổ sung 400 μl môi trƣờng LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi tiến hành lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 37оC. sử dụng que cấy trải, trải 200 μl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin 100 mg/l, X- gal (40 mg/l) và IPTG 100 μM.

- Ủ đĩa ở 22оC trong 16h.

- Chọn những khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng đƣợc bổ sung ampicillin, để qua đêm.

2.3.1.6. Tách chiết plasmid

Sau khi kiểm tra sản phẩm clony-PCR tiến hành tách plasmid bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Các bƣớc tách chiết plasmid:

(1) Lấy dịch vi khuẩn li tâm 3000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch thu cặn. (2) Hòa cặn trong 250 l Resuspension Buffer for plasmid (Buffer 1), đảo nhẹ.

(3) Bổ sung 250 l Lysis Buffer for plasmid (Buffer 2) vào ống trên, đảo nhẹ. (4) Bổ sung 350 l Neutralization Buffer for plasmid (Buffer 3), đảo nhẹ để tránh kết tủa cục bộ.

(5) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi cho chảy qua cột tinh sạch plasmid của hãng Bioneer.

(6) Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. (7) Bổ sung 500 l Denaturation Buffer for plasmid (Buffer D), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.

(8) Bổ sung 700 l Washing Buffer for plasmid (Buffer 4), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.

(9) Đặt cột sang ống 1,5 ml mới, cho 20 l H2O vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 phút và li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu nhận plasmid.

Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.

2.3.2. Phƣơng pháp phân tích trình tự gen

Trình tự của gen đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ NHÂN BẢN GEN DREB5 TỪ HỆ GEN CỦA HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG XLS VÀ LBG GIỐNG ĐẬU TƢƠNG XLS VÀ LBG

3.1.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng

Mọi nghiên cứu về hệ gen đều bắt đầu từ việc tách chiết đƣợc DNA

hoặc RNA ở dạng tinh sạch. Đậu tƣơng có hàm lƣợng protein và RNA cao, vì

vậy để thu nhận dung dịch DNA ở dạng tinh sạch sẽ gặp khó khăn hơn so với các đối tƣợng khác.

Lá non 7 ngày tuổi của các giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc sử dụng để tách DNA hệ gen.

Mẫu lá non đƣợc giữ ở - 85оC cho tới khi sử dụng. Lá non đƣợc nghiền

thành bột mịn trong cối chày sứ để ở - 85оC. DNA của hệ gen đƣợc chiết ra

khỏi tế bào nhờ dung dịch đệm rửa: Tris HCl 1M; EDTA 0,5M; pH= 8; Sorbotol 2M; NaH2PO4 0,4%; H2O và dung dịch đệm tách: Tris HCl 1M;

EDTA 0,5M; pH= 8; NaCl 5M; CTAB 4%; H2O.

Do trong tế bào đậu tƣơng chứa hàm lƣợng protein cao nên sử dụng chloroform để xử lý dịch chiết nhằm loại bỏ hoàn toàn protein ra khỏi chế phẩm DNA.

Từ 200g mẫu nghiên cứu, chúng tôi thu đƣợc 30μl dung dịch chiết DNA. Các mẫu DNA có độ tinh sạch đƣợc kiểm tra trên máy quang phổ ở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

bƣớc sóng = 260/280nm và có đỉnh cực đại ở bƣớc sóng 260nm. Kết quả đo

trên máy quang phổ để xác định hàm lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số tách chiết đƣợc, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1 cho thấy tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,83- 1,93 chứng tỏ rằng các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, ít lẫn protein có thể sử dụng để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 3.1. Giá trị mật độ quang của phổ hấp thụ DNA ở bƣớc song 260nm và 280nm của giống đậu tƣơng XLS và LBG

Tên giống A260 A280 Tỷ số A260/A280

Hàm lƣợng DNA (ng/µl)

XLS 0,318 0,165 1,93 795

LBG 0,223 0,121 1,84 557,5

Sau khi xác định nồng độ, chế phẩm DNA đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả cho thấy mẫu DNA thu đƣợc sáng rõ và gọn. Điều này chứng tỏ DNA đƣợc tách chiết từ các giống đậu tƣơng đều tƣơng đối sạch, không bị đứt gãy, ít tạp chất và có thể sử dụng để nhân gen bằng kỹ thuật PCR.

Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 2 giống XLS và LBG

1. XLS; 2. LBG

3.1.2. Kết quả nhân bản gen GmDREB5 bằng phản ứng PCR

Trên cơ sở xác định đƣợc nồng độ DNA khuôn tối ƣu cho phản ứng

PCR, chúng tôi tiến hành nhân gen GmDREB5 của giống đậu tƣơng XLS và

LBG. Sử dụng DNA hệ gen làm khuôn để nhân gen GmDREB5 với cặp mồi

1 1 2 2

Dreb5soyF/Dred5soyR (5’-ATGCAATTCCCTCACCAATT– 3’ và 5’- TCAATCCTGATCCTTCCACA) đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của gen DREB5 ở đậu tƣơng đƣợc công bố trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số EF583447. Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ

gắn mồi là 53C. Sau 30 chu kỳ phản ứng, sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng

điện di trên gel agarose 1,0%.

Kết quả nhân gen GmDREB5 cho thấy, gen GmDREB5 ở cả hai giống đậu tƣơng XLS và LBG đều có kích thƣớc phân tử ƣớc tính khoảng 920 bp. Kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế cặp mồi để nhân gen này.

Trong khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu Dreb5soyF/Dred5soyR để nhân gen GmDREB5 ở đậu tƣơng, ngoài phần đặc hiệu chúng tôi có bổ sung điểm cắt của enzyme giới hạn (6 nucleotide) ở 2 đầu của mồi xuôi và mồi ngƣợc. Do vậy, lƣợng DNA đƣợc nhân lên nhờ phản ứng PCR đủ để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen GmDREB5

1. XLS; 2. LBG; M. marker 1 kb

920 bp

3.2. TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN GmDREB5

Sau khi thu nhận đƣợc gen GmDREB5 bằng PCR, sản phẩm PCR tinh

sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5 và tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng LB agar có bổ sung Kanamycin và X- gal, để qua đêm. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3.

Khi trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc xanh và trắng, lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong LB lỏng có bổ sung đƣợc bổ sung ampicillin, để qua đêm. Tế bào tái tổ hợp đƣợc thu lại bằng cách li tâm và tách chiết plasmid tái tổ hợp.

Sau khi biến nạp và chọn dòng đã đƣợc thực hiện tốt, phản ứng PCR đã đạt mức tối ƣu, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách plasmid theo bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Sản phẩm tách plasmid đƣợc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Hình 3.3. Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng DH5 chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB5

kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.

Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid mang gen GmDREB5 của hai

giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc thể hiện ở hình 3.4.

Hình 3.4. Plasmid mang gen GmDREB5

Kết quả điện di trên hình 3.4 cho thấy, sản phẩm tách dòng gen và plasmid đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng. Những mẫu có vạch tƣơng ứng với vị trí 920 bp thì có thể sử dụng để đọc trình tự.

Để xác định trình tự nucleotide của gen GmDREB5 đã tách dòng,

chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen GmDREB5 trên máy đọc

trình tự tự động ABI- 3130 DNA capillary electrophoresis system.

Kết quả đọc trình tự đƣợc đem phân tích bằng phần mềm BioEdit. Kết quả cho thấy chiều dài gen GmDREB5 ở hai mẫu nghiên cứu có kích thƣớc 924 nucleotide. Khi so sánh trình tự này trong Ngân hàng gen quốc tế, kết quả đã xác nhận đây là trình tự gen mã hoá protein DREB5 của cây đậu tƣơng.

Thẳng Xoắn Siêu xoắn

Chúng tôi kết luận đã nhân, tách dòng thành công và xác định trình tự

đƣợc đoạn gen GmDREB5 của giống đậu tƣơng XLS và LBG.

Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5

phân lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS, kết quả so sánh đƣợc trình bày ở hình 3.5.

Hình 3.5. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS

Khi so sánh trình tự gen GmDREB5 của 2 giống LBG và XLS, chúng tôi nhận thấy có sự sai khác ở 73 vị trí nucleotide (28, 37, 40, 43, 54, 58, 80, 83, 111, 129, 139, 141, 157, 165, 174, 177, 183, 227, 264, 270, 294, 296, 308, 333, 357, 453, 467, 483, 486, 489, 498, 508, 529, 533, 547, 564, 573, 589, 598, 601, 602, 609, 622, 624, 639, 642, 648, 651, 663, 672, 678, 681, 683, 686, 691, 696, 698, 711, 724, 747, 779, 788, 865, 867, 868, 897, 907, 909, 922, 934, 936, 938, 939).

Kết quả cho thấy, hệ số đồng dạng về trình tự gen GmDREB5 của 2 giống đậu tƣơng LBG và XLS tƣơng đối cao, đạt 91,7 %.

3.3. SO SÁNH TRÌNH GEN GmDREB5, TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA PROTEIN DREB5 Ở HAI GIỐNG ĐẬU TƢƠNG XLS VÀ LBG VỚI CÁC TRÌNH TỰ ĐÃ CÔNG BỐ

3.3.1. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 của hai giống đậu tƣơng XLS và các trình tự đã công bố

Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5

phân lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS với 6 trình tự nucleotide của gen GmDREB5 đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI) có các mã số: EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở hình 3.6.

Hình 3.6. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân lập từ hai giống đậu tƣơng LBG và XLS với 6 trình tự nucleotide của gen

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB5 phân lập từ hai

giống đậu tƣơng LBG và XLS với sáu trình tự nucleotide của gen GmDREB5

đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế cho thấy: Trình tự nucleotide của gen

GmDREB5 của 2 giống LBG và XLS có một số sai khác với cả 6 trình tự nucleotide phân lập từ đậu tƣơng đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số EF583447, FR822737, HE598783, HE648567, HE647690, HE648568 tại một số vị trí nucleotide.

Kết quả xác định hệ số tƣơng đồng và khoảng cách di truyền về gen

GmDREB5 của 8 giống đậu tƣơng LBG, XLS, EF583447, FR822737,