3. Nội dung nghiên cứu
3.1.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng
Mọi nghiên cứu về hệ gen đều bắt đầu từ việc tách chiết đƣợc DNA
hoặc RNA ở dạng tinh sạch. Đậu tƣơng có hàm lƣợng protein và RNA cao, vì
vậy để thu nhận dung dịch DNA ở dạng tinh sạch sẽ gặp khó khăn hơn so với các đối tƣợng khác.
Lá non 7 ngày tuổi của các giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc sử dụng để tách DNA hệ gen.
Mẫu lá non đƣợc giữ ở - 85оC cho tới khi sử dụng. Lá non đƣợc nghiền
thành bột mịn trong cối chày sứ để ở - 85оC. DNA của hệ gen đƣợc chiết ra
khỏi tế bào nhờ dung dịch đệm rửa: Tris HCl 1M; EDTA 0,5M; pH= 8; Sorbotol 2M; NaH2PO4 0,4%; H2O và dung dịch đệm tách: Tris HCl 1M;
EDTA 0,5M; pH= 8; NaCl 5M; CTAB 4%; H2O.
Do trong tế bào đậu tƣơng chứa hàm lƣợng protein cao nên sử dụng chloroform để xử lý dịch chiết nhằm loại bỏ hoàn toàn protein ra khỏi chế phẩm DNA.
Từ 200g mẫu nghiên cứu, chúng tôi thu đƣợc 30μl dung dịch chiết DNA. Các mẫu DNA có độ tinh sạch đƣợc kiểm tra trên máy quang phổ ở
bƣớc sóng = 260/280nm và có đỉnh cực đại ở bƣớc sóng 260nm. Kết quả đo
trên máy quang phổ để xác định hàm lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số tách chiết đƣợc, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 cho thấy tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,83- 1,93 chứng tỏ rằng các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, ít lẫn protein có thể sử dụng để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.1. Giá trị mật độ quang của phổ hấp thụ DNA ở bƣớc song 260nm và 280nm của giống đậu tƣơng XLS và LBG
Tên giống A260 A280 Tỷ số A260/A280
Hàm lƣợng DNA (ng/µl)
XLS 0,318 0,165 1,93 795
LBG 0,223 0,121 1,84 557,5
Sau khi xác định nồng độ, chế phẩm DNA đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả cho thấy mẫu DNA thu đƣợc sáng rõ và gọn. Điều này chứng tỏ DNA đƣợc tách chiết từ các giống đậu tƣơng đều tƣơng đối sạch, không bị đứt gãy, ít tạp chất và có thể sử dụng để nhân gen bằng kỹ thuật PCR.
Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 2 giống XLS và LBG
1. XLS; 2. LBG