Vì chất xơ của nấm là chitin khi bị thủy phân sẽ tạo thành glucosamine nên khi khảo sát hàm lượng glucosamine sẽ biết được sự tăng trưởng của nấm.
• Nguyên tắc
Các đường N-acetyl hay amino-sugar được đun nóng trong một dung dịch kiềm để hình thành chất tạo màu, sản sinh ra một phức hợp màu đỏ tía khi phản ứng với N,N-dimethyl-p-aminobenzaldehyde trong dung dịch acid ( thuốc thử Ehrlich). Số lượng đường tạo thành được xác định bằng cách so màu trên máy quang phổở bước sóng xấp xỉ 585nm.
• Hóa chất:
Dung dịch glucosamine standard stock – 10g/1 : Cân 1g glucosamine và hòa tan trong nước cất, pha thành 100ml dung dịch
Dung dịch thuốc thử Ehrlich: 1g N,N-dimethyl-p-aminobenzaldehyde 50ml acid acetic
1.5ml acid HCl 10N 0.8M potassium tetraborate.
• Tiến hành thí nghiệm: Dựng đường chuẩn
+ Xây dựng đường chuẩn glucosamine với nồng độ từ 5 - 20 µg/µl + Dung dịch glucosamine chuẩn: Pha loãng từ dung dịch gốc với nước cất Thực hiện một loạt 4 ống nghiệm theo bảng sau.
Bảng 2.5: Các bước tiến hành dựng đường chẩn glucosamine
Ống nghiệm số 1 2 3 4 Nồng độ glucosamine (µg/µl) 5 10 15 20 Dung dịch glucosamine (ml) 1 1 1 1 0.8M potassium tetraborate (ml) 1 1 1 1 Đun nóng (phút) 10 10 10 10 Làm lạnh 9 9 9 9 Thuốc thử Ehrlich (ml) 3 3 3 3
Tiến hành mẫu thí nghiệm: Các bước tiến hành tương tự bảng 2.5, dung dịch glucosamine chuẩn thay bằng dung dịch mẫu thí nghiệm.
2.2.1.8. Phương pháp nuôi cấy và bảo quản giống nấm men
- Chuẩn bị môi trường YPD gồm: Peptone: 20g
D-glucose: 20g Yeast extract: 10g Nước cất: 1000ml - Tiệt trùng
Giống nấm men trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối , tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm , chúng tôi tiến hành nhân giống qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn 1: Sau khi nấm men đã phát triển trên môi trường thạch nghiêng, chúng tôi cấy vào erlen chứa 20ml dịch môi trường YPD đã được hấp tiệt trùng, tiếp đó nuôi ở nhiệt độ thường ( 28- 300C ) trong 24 giờ.
+ Giai đoạn 2 : lấy 100ml dịch môi trường YPD cho vào erlen 250ml, hấp tiệt trùng, để nguội, cho toàn bộ nấm men trong erlen đã nuôi giống ( giai đoạn 1) vào erlen và nuôi ởđiều kiện 300C , 24 giờ.
2.2.1.9. Điện di phân tích protein
Trước khi tiến hành chạy điện di, tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme endoglucanase và β- glucosidase trên môi trường CMC agar vì CMC là cơ chất của endoglucanase. Các bước tiến hành như sau:
Chuẩn bị môi trường CMC agar với 2% CMC và 1.75% agar - Hấp khử trùng
- Đổđĩa, đục lỗ
- Cho 1ml dịch nuôi cấy vào đĩa ủở 370C trong 2 giờ - Nhuộm với Congo red 1% trong 30 phút
- Bỏ Congo red
- Rửa với NaCl 1M trong 15 phút - Xem kết quả
Sau khi kiểm chứng, tiến hành chạy điện di với nguyên tắc và các bước cụ thể như sau
¾ Nguyên tắc
Phương pháp điện di biến tính, các protein được phản ứng với các chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm là SDS để tạo thành một phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về cực dương của điện trường, SDS kết hợp với phần kỵ nước của protein và phá vỡ cấu trúc xoắn làm cho protein trở nên ổn định. Thêm vào đó một chất khử là mercaptoethanol hoặc dithithreiot (DTT) để phá vỡ cầu nối –S-S- (disulfur) của protein (và các tiểu đơn vị của chúng). Nhờđó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein trong cùng một điều kiện chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua lỗ gel có kích thước nhất định.
¾ Chuẩn bị
a) Dung dịch stock
+ 2 M Tris-HCl (pH 8.8), 100 ml: Cân 24.2 g Tris HCl, thêm 50 ml nước khử ion, điều chỉnh về pH 8.8 bằng acid HCl đậm đặc. Định mức với nước thành 100 ml.
+ 1 M Tris-HCl (pH 6.8), 100 ml: Cân 12.1 g Tris base, thêm 50 ml nước khử ion, điều chỉnh về pH 6.8 bằng acid HCl đậm đặc. Định mức với nước thành 100 ml.
+ 10% SDS (w/v), 100 ml, dự trữ ở nhiệt độ phòng: Cân 10 g SDS, hòa tan trong nước và thêm nước thành 100 ml.
+ 50% glycerol (v/v), 100 ml: Đổ 50 ml glycerol 100%, thêm 100 ml nước khử ion.
+ 1% bromophenol blue (w/v), 10 ml: Cân 10 mg bromophenol blue, hòa tan trong 10 ml nước cất, khuấy cho đến khi hòa tan hết. Lọc để loại bỏ thuốc nhuộm còn tủa lại.
b) Dung dịch cho điện di biến tính
+ Dung dịch A ( Dung dịch Acrylamide chuẩn), 100 ml 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bis- acrylamide
• Acrylamide : 29.2 g
• Bis- acrylamide : 0.8 g Hòa tan bằng nước cất, định mức đến 100 ml + Dung dịch B (4x separating gel buffer), 100 ml
• 2 M Tris-HCl (pH 8.8) : 75 ml
• 10% SDS : 4 ml
• Nước khử ion : 21 ml + Dung dịch C (4x stacking gel buffer), 100 ml
• 1 M Tris-HCl (pH 6.8) : 50 ml • 10% SDS : 4 ml • Nước khử ion : 46 ml + 10% ammonium persulfate , 5 ml • Ammonium persulfate : 0.5 g • Nước khử ion : 5 ml + Đệm chạy điện di, 1 lít • Tris base : 3 g • Glycine : 14.4 g • SDS : 1 g • Nước khử ion : 1 lít • pH khoảng : 8.3 + Sample buffer 5x, 10 ml • 1 M Tris-HCl (pH 6.8) : 0.6 ml • 50% glycerol : 5 ml • 10% SDS : 2 ml • 2-mercaptoethanol : 0.5 ml
• 1% bromophenol blue : 1 ml + Dung dịch nhuộm Coomasie Blue
• Coomasie Blue R-250 : 1 g • Methanol : 450 ml • Acid acetic đậm đặc : 100 ml • Nước khử ion : 450 ml + Dung dịch giải nhuộm • Methanol : 100 ml • Acid acetic đậm đặc : 100 ml • Nước khử ion : 800 ml ¾ Tiến hành Chuẩn bị gel
+ Dung dịch separating gel 12%
• Dung dịch A : 4 ml
• Dung dịch B : 2.5 ml
• Nước khử ion : 3.445 ml
• TEMED : 5 µl
• Ammonium persulfate 10% : 50 µl + Dung dịch stacking gel 5%
• Dung dịch A : 0.67 ml
• Dung dịch C : 1 ml
• Nước khử ion : 2.3 ml
• TEMED : 5 µl
• Ammonium persulfate 10% : 30 µl
+ Chuẩn bị mẫu protein: Pha mẫu + Sample buffer 5x trong 1 eppendort (20 µl mẫu + 5 µl Sample buffer) đun cách thủy (100oC, 2–10 phút) ly tâm (15000 vòng/phút, trong 1 phút).
Chuẩn bị gel
Đổ separating gel
Đổ stacking gel
(Sau khi gel polymer hóa, 30- 60 phút)
Chèn lược vào khuôn gel (tránh xuất hiện bóng khí) Để gel polymer hóa khoảng 30 phút (gel đông)
Rút lược, chuyển đĩa gel vào đệm điện di
buồng điện di
Chuẩn bị mẫu Bơm mẫu vào giếng
Chạy điện di gel biến tính
Nhuộm gel với Coomasie Blue (30 phút, trên máy lắc nhẹ)
Bỏ nhuộm, rửa với nước cất vài lần
Ghi nhận kết quả
2.2.1.10. Đo nồng độ cồn bằng máy sắc ký khí khối phổ GC/MS-haedspace haedspace
Khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện hay ion trong một điện trường nhất định.
Kỹ thuật này có nhiều ứng dụng, thường kết hợp với một số kỹ thuật sinh học phân tử như: Khối phổ kết hợp với sắc ký khí, sắc ký lỏng hay kết hợp với điện di Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ: Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình đo khối phổ. Đểđo được đặc tính của các phân tử cụ thể, máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các ion, kiểm soát chuyển động của chúng bởi các điện từ trường bên ngoài. Quá trình được thực hiện trong môi trường chân không.
Trong khi áp suất khí quyển vào khoảng 760mmHg, áp suất môi trường xử lý ion thường từ 10-5 đến 10-8 mmHg (thấp hơn một phần tỉ của áp suất). Ion sau khi được tạo thành sẽ được phân tách bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài. Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo ra sẽđược phân tích và lưu trữ trong một máy tính
Phương pháp sắc ký khí kết hợp với khối phổ (GC/MS) là một phương pháp mãnh mẽ với độ nhạy cao được sử dụng trong nghiên cứu về thành phần các chất trong không khí. Ngưỡng phát hiện của phương pháp này là 1 picogram. Cấu tạo gồm:
- Cửa tiêm: 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống tại cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 3000C để mẫu trở thành dạng khí
- Cột: Bên trong hệ thống GC là một cột ống nhỏ có chiều dài 30m với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được phân tích bằng cách chạy dọc theo cột này.
Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc. Hệ thống máy tính sẽ chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết quả khối phổ.
GC/MS có thể phân tách các hỗn hợp hóa chất phức tạp trong không khí hay trong nước. Ở đây, tốc độ được quyết định bởi tính bay hơi. Chất nào có tính bay hơi cao sẽ di chuyển nhanh hơn chất có tính bay hơi thấp.
GC/MS có thểđịnh lượng một chất bằng cách so sánh với mẫu chuẩn, là chất biết trước và đã được định lượng chuẩn bằng GC/MS. Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó. Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc của các chất đã biết. Nếu không tìm được chất tương ứng trong thư viện, ta thu được một dữ liệu mới và đóng gói vào thư viện cấu trúc sau khi tiến hành thêm các biện pháp để xác định chính xác loại hợp chất này.
2.2.2. Trình tự nghiên cứu 2.2.2.1. Sơ đồ thí nghiệm 2.2.2.1. Sơ đồ thí nghiệm Rơm rạ Tiền xửlý Thủy phân Lên men Hấp khửtrùng
Hê thống enzyme của nấm rơm
Thu lấy dịch nuôi cấy Ủ ởnhiệt độ650C 15 ngày 30 ngày 60 ngày Cắt nhỏtừ1-2 cm Đo nồng độcồn Cellulase Xylanase pH Thành phần rơm rạ Glucose
Điện di phân tích protein
Hình 2.4 : Quy trình tiến hành thí nghiệm
2.2.2.2. Tiền xử lý
Nguyên liệu trong môi trường trồng nấm cần phải ủđống
Ởđây chúng tôi tiến hành ủ rơm trong 24 giờ nhằm mục đích làm cho cấu trúc rơm mềm ra để các enzyme của nấm rơm tấn công dễ dàng lên cấu trúc rơm rạ.
Rơm rạđược cắt nhỏ từ 1-2 cm
2.2.2.3. Thủy phân
Sau khi tiền xử lý, nguyên liệu được đem đi hấp khử trùng và ủ với các chủng nấm rơm.
Điều kiện nuôi cấy: Độẩm 70%, bổ sung thêm dung dịch HVP thành phần như bảng 2.6. Bảng 2.6: Các thành phần của HVP THÀNH PHẨN HÀM LƯỢNG Đạm tổng số (N) 70g/l Lân hữu hiệu (P2O5) 60g/l Kali 40g/l Magnesium 180mg/l Boron (B) 50mg/l Kẽm (Zn) 50mg/l Managese (Mn) 50mg/l Đồng (Cu) 50mg/l Mo 5mg/l
Theo dõi và khảo sát các hoạt tính enzyme của nấm rơm ở 15, 30 và 60 ngày nuôi cấy.
2.2.2.4.. Lên men
Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính của các enzyme theo từng mốc thời gian, xem trong khoảng thời gian nào hàm lượng đường cao nhất thì lên men dịch đường trong giai đoạn đó. Sau thời gian lên men 72 giờ, mẫu được đem đi đo nồng độ cồn bằng máy sắc ký khí khối phổ.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hoạt tính enzyme FPase, cellulase, xylanase và laccase của mẫu
Khả năng thủy phân của các chủng nấm rơm nhờ vào các enzyme FPase, cellulase và xylanase. Ngoài ra còn có sự tham gia của laccase nhằm hỗ trợ cho FPase, cellulase và xylanase hoạt động hiệu quả hơn. Để đánh giá hoạt lực của các enzyme trên chúng tôi tiến hành thu dịch nuôi cấy ở các mốc thời gian 15, 30 và 60 ngày. Kết quảđược trình bày trong bảng 3.1, 3.2. và hình 3.1
Bảng 3.1: Hoạt tính enzyme FPase, cellulase, và xylanase của mẫu
Mẫu FPase (UI/g) Cellulase (UI/g) Xylanase (UI/g)
BT15 0.298 0.093 0.800 BT30 0.836 0.013 0.499 BT60 1.487 0.061 0.328 NL15 0.209 0.110 2.646 NL30 0.367 0.009 0.328 NL60 0.436 0.017 1.360 TP15 0.169 0.063 0.506 TP30 0.744 0.013 1.360 TP60 0.939 0.066 0.774 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 F P ase ( U I/ g ) BT15 BT30 BT60 NL15 NL30 NL60 TP15 TP30 TP60 MẪU BT15 BT30 BT60 NL15 NL30 NL60 TP15 TP30 TP60
Kết quả bảng cho thấy hoạt lực FPase của các chủng khác nhau là không giống nhau. Chủng BT có hoạt lực FPase cao nhất (0.298 UI/g), tiếp theo là mẫu NL (0.209UI/g) và cuối cùng là mẫu TP (0.169UI/g). Sự khác nhau này là do các chủng khác nhau có điều kiện sinh trưởng và khả năng phân giải cellulose khác nhau.
Theo dõi qua từng mốc thời gian nhận thấy hoạt lực các mẫu đều tăng dần theo thời gian, điều này có thể do hoạt tính FPase không bịức chế bởi các yếu tố như hàm lượng cơ chất đường tạo thành hay pH của môi trường nuôi cấy.
0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 CE L L UL AS E ( U I/ g ) BT15 BT30 BT60 NL15 NL30 NL60 TP15 TP30 TP60 MẪU BT15 BT30 BT60 NL15 NL30 NL60 TP15 TP30 TP60
Hình 3.2: Hoạt tính cellulase theo thời gian nuôi cấy
Trong khi đó hoạt lực cellulase của các mẫu cũng khác nhau và khác với hoạt lực cellulase tổng. Ở đây, mẫu NL cao nhất (0.110UI/g), mẫu BT (0.093UI/g), mẫu TP (0.063UI/g). Trong 15 ngày nuôi cấy hoạt lực các mẫu đạt cao nhất so với những ngày sau đó, sau 30 ngày hoạt lực giảm nhanh và sau 60 ngày thì hoạt lực tăng lên nhưng chỉ tăng nhẹ, thấp hơn nhiều so với 15 ngày đầu, điều này được giải thích có thể do môi trường pH không thích hợp cho hoạt động của enzyme từ 15-30 ngày nuôi cấy.
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 XYL A N A SE( U I/ g ) BT15 BT30 BT60 NL15 NL30 NL60 TP15 TP30 TP60 MẪU BT15 BT30 BT60 NL15 NL30 NL60 TP15 TP30 TP60
Hình 3.3: Hoạt tính xylanase theo thời gian nuôi cấy
Đối với hoạt lực xylanase thì cũng có sự khác nhau giữa các chủng, cao nhất vẫn là mẫu NL (2.646UI/g). Sau 15 ngày nuôi cấy hoạt tính enzyme tăng mạnh sau đó giảm dần đến 60 ngày.
Có sự khác nhau giữa các hoạt tính enzyme là do các chủng nấm khác nhau có khả năng phân giải cellulose và hemicellulose khác nhau, có loài phân giải cellulose mạnh và ngược lại có loài phân giải hemicellulose mạnh. Từ bảng kết quả cho phép ta chọn chủng NL nuôi cấy 15 ngày cho hoạt lực enzyme thủy phân cao nhất.
Đối với enzyme laccase, hoạt lực của enzyme này ở các chủng nấm rơm rất thấp cho thấy quá trình phân hủy lignin, tách lignin ra khỏi cellulose và hemicellulose chưa hiệu quả. So sánh hoạt tính enzyme laccase giữa các chủng theo từng mốc thời gian nuôi cấy cho thấy chủng NL cũng có hoạt lực cao nhất và hoạt lực của các chủng này tăng đều theo thời gian. Kết quảđược trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.4
Bảng 3.2: Hoạt tính laccase của mẫu 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 L ACCA S E ( U /l ) BT15 BT30 BT60 NL15 NL30 NL60 TP15 TP30 TP60 MẪU BT15 BT30 BT60 NL15 NL30 NL60 TP15 TP30 TP60
Hình 3.4: Hoạt tính laccase theo thời gian nuôi cấy 3.2. Sự thay đổi pH theo thời gian:
pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng nấm rơm và hoạt tính của enzyme. Để kiểm tra sự thay đổi pH cơ chất theo thời gian và qua đó có thể xem ảnh hưởng của pH đối với sự sinh trưởng, hoạt tính enzyme của nấm rơm, chúng tôi tiến hành đo pH của cơ chất. Kết quảđược trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.5.