Box cấy vô trùng Máy đo quang phổ hấp phụ Kính hiển vi Cân điện tử Nồi khử trùng, tủ sấy Tủ nuôi ổn nhiệt Máy ly tâm Máy điện di protein Ống sinh hàn hồi lưu Các dụng cụ thí nghiệm khác 2.1.3. Hóa chất
+ Các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm acetate: CH3COOH và CH3COONa, Tween 20, CaCl2.
+ Các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4: Na2HPO4.12H2O và KH2PO4.
+ Các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm Glycine – HCl: Glycine (C2H5NO2) và HCl đặc (37%).
+ Các hóa chất dùng để xác định hoạt tính cellulase, xylanase và laccase: Glucose (Trung Quốc), xylose (Merk), Xylan, CMC, ABTS.
+ Các hóa chất dùng để pha thuốc thử DNS: 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid (Merk), Potassium solusion tartate tetrahydrate (Trung Quốc), NaOH, KOH.
Thuốc thử Bradford (Bio- Rad).
+ Các hóa chất dùng trong phương pháp điện di: Acrylamide stock 30% , Bis- Acrylamide ( N,N’-methylenebisacrylamide), Tris-2-hydroxymethyl sulfate, SDS (sodium dodecyl sulfate hay sodium lauryl sulfate), TEMED (N,N,N,N’- tetramethylenediamide), Amonium persulfate, Glycerol, Bromophenol blue, Glycine, HCl, 2-mereaptoethanol.
+ Các hóa chất dùng để xác định các thành phần rơm rạ: acid sulfuric 72% 24N, ethanol 95%, benzene, NaOH 0,5%, HCl 10% .
+ Các hóa chất dùng để xác định hàm lượng glucosamine: glucosamine, N,N- dimethyl-p-aminobenzaldehyde, potassium tetraborate, HCl, acid acetic.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân tích
2.2.1.1. Phương pháp xác định hoạt tính FPase
• Dung dịch thí nghiệm
1. Giấy lọc: Đươc cắt thành từng mảnh có kích thước 1.0 x 6.0 cm, tương ứng với khối lượng 50mg
Chú ý: Kiểm tra mỗi mảnh giấy lọc để đảm bảo rằng sự thay đổi (chênh lệch) khối lượng ít hơn 1mg mỗi mảnh. Cầm giấy lọc với găng tay hay kẹp để cân giấy lọc chính xác.
2. Thuốc thử DNS ( 3.5-dinitrosalicylic acid) : 10.6g DNS và 19.8g NaOH trong 1416ml nước cất. Sau khi hòa tan hoàn toàn, thêm 306g Sodium potassium tartrate,
7.6ml phenol ( đã được đun chảy ở 500C), và 8.3g Sodium matebisufite, và trộn đều. Chuẩn độ 3ml thuốc thử DNS có sử dụng 0.1 M HCl và đồng thời sử dụng phenoltalein để kiểm tra điểm cuối pH. Để mất màu phenoltalein thì cần khoảng 5- 6ml HCL. Thêm NaOH nếu cần (2g NaOH thêm vào = 1ml HCl 0.1M được sử dụng cho 3ml thuốc thử DNS).
Chú ý:
- Thuốc thử DNS có thể trữ trong bình tối ở 40C ít nhất một tháng. Nó có thể mất khả năng khử sau thời gian trữ dài. Pha mới thuốc thử DNS thường bị lờ đi
- Cầm chai phenol một cách cẩn thận.
3. Đệm citrate ( 1M, pH 4.5) : Hòa tan 210g citric acid monohydrate trong 750ml nước cất, và thêm 50-60g NaOH rắn cho đến khi pH= 4.3. Pha loãng dung dịch đến gần 1000ml và kiểm tra pH. Nếu cần thiết thêm NaOH để chỉnh pH đến 4.5
4. Đệm citrate (50mM, pH 4.8) : Pha loãng đệm citrate 1M, pH 4.5 bằng cách thêm 19 lần nước cất.
5. Dung dịch glucose chuẩn– 10g/1 : Cân 1g glucose và hòa tan trong nước cất, pha thành 100ml dung dịch.
Chú ý : Dung dịch glucose chuẩn có thể được đóng nắp chặt vào bảo quản lạnh. Dung dịch nên được trộn kỹ sau khi tan.
• Tiến hành
1. Đặt mảnh giấy lọc được cuộn tròn vào mỗi ống nghiệm.
2. Thêm 1ml đệm citrate 50mM ( pH 4.8 ) vào ống nghiệm , và giấy lọc nên ngập chìm trong đệm đun cách thủy 5 phút đểđuổi oxy làm nguội. 3. Chuẩn bị dãy enzyme pha loãng, sao cho ít nhất là mỗi mẫu enyme thu được
phải có 2 đô pha loãng, với một độ pha loãng giải phóng nhẹ nhàng hơn 2.0mg glucose ( ~ 2.1mg ) và một giải phóng ít hơn 2.0mg glucose ( 1.9mg ). 4. Chuẩn bị dilute glucose standards ( GSs ) như sau :
GS1 : 1.0ml glucose standard stock + 4.0 ml đệm = 2mg/ml ( 1.0mg/o,5ml). GS2 : 1.0 ml glucose standard stock + 2.0ml = 3.3mg/ ml ( 1.65mg/ 0.5ml ).
GS3 : 1.0 ml glucose standard stock + 1.0ml = 5mg/ml ( 2.5mg/0.5ml ) GS4 : 1.0 ml glucose standard stock + 0.5ml đệm = 6.7mg/ml ( 3.35mg/0.5ml Thêm 0.5ml dung dịch GSl – 4 vào ống nghiệm , và thêm 1.0ml đệm citrate 50mM pH 4.8.
5. Chuẩn bịống trống blank và ống chứng controls. - Reagent blank ( RB) : 1.5 ml đệm citrate 50mM pH 4.8.
- Enzyme controls ( EC1 – 5): 1.0ml đệm citrate 50mM pH 4.8 + 0.5ml enzyme pha loãng
- Substrate control (SC ) : 1.5ml đệm citrate 50mM pH 4.8 + mảnh giấy lọc.
6. Ủ ấm trước ở 500C những dung dịch enzyme ( được pha loãng), blank, and controls đến khi đạt trang thái cân bằng ( nghĩa là ở nhiệt độ dung dịch = nhiệt độ đểủ , khoảng 10 phút.)
7. Thêm 0.5ml dung dịch enzyme pha loãng vào ống nghiệm có cơ chất giấy lọc (EC 1 – EC 5)
8. Ủ những ống nghiệm E 1- 5, GSs,RB, EC 1-5, và SC ở 500C trong bể ủ nhiệt khoảng 60 phút.
9. Thêm 3ml thuốc thử DNS để dừng phản ứng và trộn đều. 10. Đun cách thủy các ống nghiệm trong 5 phút.
11. Chuyển các ống nghiệm đến một bể nước đá lạnh để làm nguội.
12. Hút 0.5ml dung dịch thí nghiêm vào eppendort 1.5ml và ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 3 phút.
13. Sau khi ly tâm , hút 0.2ml dịch nổi phía trên vào trong một ống nghiệm khác và thêm 2.5ml nước cất , trộn đều.
14. Đem đo độ hấp thụở bước sóng 540m va RB được sử dụng làm ống blank.
• Tính toán
1. Vẽ đường chuẩn glucose ( hàm lượng glucose nằm trục x, độ hấp thu ở 540 nằm trục y.
2. Tính nồng độ glucose thực được giải phóng bởi dãy enzyme pha loãng E 1- 5 dưa theo đường chuẩn glucose
3. Vẽ mối quan hệ giữa những nồng độ glucose thực và dãy nồng độ enzyme pha loãng ( EDRs ).
4. Nối những điểm ít hơn 2mg và nhiều hơn 2mg bằng một đường thẳng và xác định EDR bằng cách sử dụng điểm cho 2mg glucose dựa vào đường thẳng. 5. Tính FPA của dung dịch enzyme gốc ban đầu theo đơn vị FPU/ml FPA = 0.37/EDR.
Trong công thức này : 2mg glucose = 2mg/( 0.18mg/umol) x 0.5ml x 60min = 0.37umol/min/ml.
Trong trường hợp hoạt tính enzyme thấp, thậm chí enzyme không pha loãng giải phóng đường khử ít hơn lượng glucose tới hạn. Trong trường hợp này hoạt tính được tính từ lượng glucose được giải phóng bởi enzyme không pha loãng như sau :
FPU = mg glucose released x 0.185
2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase, xylanase:
• Nguyên tắc
Nguyên tắc này dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC và xylan bởi cellulase và xylanase ở pH 5 và 40oC. Lượng đường khử sinh ra phản ứng với 2-hydroxy- 3,5-dinitrobenzoic acid (DNS) cho dung dịch có màu vàng - cam. Dung dịch màu này được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 530 nm. Lượng đường khử tạo ra được xác định từ đường chuẩn glucose và xylose được xây dựng trước.
• Hóa chất
+ Dung dịch Tween 20, 10%: Hòa tan 10 g Tween 20 với nước cất, định mức thành 100ml
+ Dung dịch đệm Acetate 0.1M, pH 5.0 với 0.04 % Tween 20: Hòa tan 13.6 g CH3COONa.3H2O và 2.94 g CaCl2.2H2O với 900 ml nước cất. Điều chỉnh pH với HCl 25% đến pH 5.0 ± 0.02. Thêm 4 ml dung dịch Tween 20, định mức bằng nước cất đến 1000 ml.
+ Dung dịch NaOH/KOH: Hòa tan 80 g NaOH và 112 g KOH với nước cất, và định mức thành 500 ml. Giữ dung dịch trong bình nhựa, ở nhiệt độ phòng.
+ Dung dịch acid 2-hydroxyl-3,5-dinitrobezoic (DNS): 5 g DNS hòa tan với 300 ml nước cất ở 50oC. Thêm 50 ml dung dịch NaOH/KOH trước khi thêm 150 g Potassium sodium tartrate tetrahydrate. Ổn định dung dịch ở nhiệt độ phòng, định mức bằng nước cất thành 500 ml. Giữ dung dịch trong bình tối, ở nhiệt độ phòng.
+ Dung dịch gốc Glucose 0.1M: Cân 1.8 g D-Glucose ( với Glucose Mw 180.16), chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng dung dịch đệm Acetate 0.1M, pH 5.0.
+ Dung dịch gốc Xylose 0.1M: Cân 1.5 g D-Xylose ( với Xylose Mw 150.13), chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng dung dịch đệm Acetate 0.1M, pH 5,0.
+ Dung dịch cơ chất CMC 2%: 2 g CMC hòa tan trong 80 ml dung dịch đệm Acetate 0.1M, pH 5.0, với 0.04% Tween 20 khuấy trên bếp cách thủy (10 phút). Làm mát ở nhiệt độ phòng, chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng dịch đệm Acetate 0.1M, pH 5.0.
+ Dung dịch cơ chất xylan 1%: 1g xylan hòa tan trong 80 ml dung dịch đệm Acetate 0.1M, pH 5.0, với 0.04% Tween 20 khuấy trên bếp cách thủy (10 phút). Làm mát ở nhiệt độ phòng, chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng dung dịch đệm Acetate 0.1M, pH 5.0.
• Dựng đường chuẩn glucose và xylose
+ Dung dịch glucose chuẩn: Pha loãng từ dung dịch gốc với đệm acetate pH 5.0.
+ Dung dịch Xylose chuẩn: Pha loãng từ dung dịch gốc với đệm acetate pH 5.0.
Thực hiện một loạt 6 ống nghiệm theo bảng sau. Các bước tiến hành dựng đường chuẩn như bảng 2.1
Ống số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ glucose/xylose (µg/µl) 0 5 10 15 20 30 Dung dịch glucose/xylose (µl) 0 60 60 60 60 60 DD đệm acetate 0.1 M, pH 5 (µl) 60 0 0 0 0 0 Dung dịch CMC 2%/xylan1% (µl) 600 600 600 600 600 600 Dung dịch DNS (µl) 300 300 300 300 300 300 Nước cất (ml) 3 3 3 3 3 3
Bảng 2.1:Các bước thực tiến hành dựng đường chuẩn glucose và xylose
Bước thực hiện Mẫu thật Mẫu blank
1. Đệm acetate 0.1M, pH=5 (µl) 0 60
2. Dung dịch glucose chuẩn (µl) 60 0
3. Ủ 40oC (phút) 5 0 4. Cơ chất (CMC/xylan) (µl) 600 600 5. Trộn đều • • 6. Ủ 40oC (phút) 20 No 7. DNS (µl) 300 300 8. Trộn đều • • 9. Đun cách thủy 10 phút 10 10 10. Làm nguội • • 11. Nước cất (ml) 3 3 12. Trộn đều • •
So màu trên máy quang phổ Hewlett-Packard 8453 với chương trình HPUV-vis Chemstations ở bước sóng 530 nm
• Tiến hành phản ứng
Thí nghiệm tiến hành mỗi mẫu với 5 ống nghiệm: 3 ống cho phản ứng (Am), 1 ống đối chứng (A0), 1 ống blank. Các bước thực hiện như bảng 2.2
Bảng 2.2:Các bước của quá trình xác định hoạt tính cellulase và xylanase Bước thực hiện Mẫu Am Mẫu A0 Blank 1. Đệm acetate 0.1M, pH=5 (µl) 0 0 60 2. Dịch enzym (µl) 60 60 0 3. Ủ 40oC (phút) 5 0 0 4. Cơ chất (CMC/xylan) (µl) 600 600 (bước 7) 600 5. Trộn đều • • • 6. Ủ 40oC (phút) 20 0 0 7. DNS (µl) 300 300 (bước 4) 300 8. Trộn đều • • • 9. Đun cách thủy 10 phút 10 10 10 10. Làm nguội • • • 11. Nước cất (ml) 3 3 3 12. Trộn đều • • •
So màu trên máy quang phổ Hewlett-Packard 8453 với chương trình HPUV-vis Chemstations ở bước sóng 530 nm
• Tính kết quả hoạt tính cellulase và xylanase
Đơn vị hoạt tính cellulase/xylanase (UI/g) được xác định như là lượng enzym phân giải tạo ra lượng đường khử tương đương với 1 µg glucose/xylose trong mỗi phút.
Hoạt tính (Unit/g hay ml) = (G*V)/(M*v*t) Trong đó:
+ G: Lượng đường khử được giải phóng bởi sự thủy phân cơ chất (µg) + V: Thể tích mẫu pha loãng (ml)
+ M: Khối lượng mẫu (g)
2.2.1.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase
Nguyên tắc: Dựa trên sự oxi hóa ABTS (2,2'azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6 sulfonic acid) bởi laccase thành hợp chất được hấp thụ ánh sáng mạnh tại bước sóng 420 nm.
Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo thành 1 μM sản phẩm từ ABTS trong thời gian 1 phút, ởđiều kiện thí nghiệm.
Thành phần phản ứng: Thành phần Đối chứng (ml) Thí nghiệm (ml) +Đệm acetate 0.8 0.6 (100mM), pH 4.5 +Dịch lên men 0.2 0.2 +ABTS (5mM) 0 0.2 +Tổng thể tích 1 1 Công thức tính: U: Hoạt độ enzyme (U/l) ε: Bước sóng 420 nm, ε= 36.000 (M-1cm-1) Vpu: Tổng thể tích phản ứng VE: Thể tích enzyme ODt: Giá trị OD đo tại thời điểm t OD0: Gía trị OD đo tại thời điểm t=0 Df: Độ pha loãng t: Thời gian phản ứng
2.2.1.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein
• Nguyên tắc
Nguyên tắc này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein.
• Chuẩn bị hóa chất
+ Thuốc thử Coomassie: Cân 5 mg Coomassie hòa tan với 22.5 g ethanol, 43.5 g H3PO4được thêm vào, định mức thành 500 ml bằng nước cất.
+ Dung dịch Albumin gốc: 1.41 mg/ml
+ Pha dãy nồng độ albumin chuẩn từ dung dịch gốc với nồng độ từ 10 - 60 µg/ml.
• Dựng đường chuẩn
Xây dựng đường chuẩn protein với nồng độ từ 10 - 60 µg/µl theo bảng 2.3
Bảng 2.3: Các bước tiến hành dựng đường chuẩn protein
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6
Albumin chuẩn (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60
Dung dịch albumin chuẩn (ml) 0 1 1 1 1 1 1
Nước cất (ml) 1 0 0 0 0 0 0
Thuốc thử Coomassie 2 2 2 2 2 2 2
Dùng micropipet hút 1 ml dung dịch albumin chuẩn với các nồng độ trên cho vào các ống nghiệm, cho vào mỗi ống nghiệm chứa albumin 2 ml dung dịch thuốc thử coomassie, trộn đều và đo độ hấp thu trên máy quang phổ Hewlett PacKard 8453 với chương trình HPUV-vis Chemstations ở bước sóng 595 nm. Ống blank được tiến hành song song, thay 1 ml dung dịch albumin bằng 1 ml nước cất.
• Tiến hành phản ứng
Hút 1 ml mẫu đã được pha loãng sao cho OD595 của mẫu đo được nằm trong khoảng OD595 của đường chuẩn. Thêm 2 ml thuốc thử Coomassie, lắc đều.
Đo độ hấp thu trên máy quang phổ Hewlett-Packard 8453 với chương trình HPUV- vis Chemstations ở bước sóng 595 nm.
• Tính kết quả
Hàm lượng protein (µg/ml) trong mẫu được xác định từ đường chuẩn protein.
Hàm lượng protein (mg/g) =( A*n*V)/(1000*m) Trong đó:
+ A: Lượng protein trong mẫu được xác định từđường chuẩn (µg/ml). + V: Thể tích pha loãng mẫu (ml).
+ n: Hệ số pha loãng.
+ m: Khối lượng mẫu lấy phân tích (g). + 1000: Hệ sốđổi từ µg ra mg
2.2.1.5. Phương pháp định lượng đường khử
a) Nguyên tắc
Lượng đường khử được xác định dựa trên việc đo mật độ quang của phức màu đỏ sậm đặc trưng được tạo ra giữa đường khử và thuốc thử DNS ở bước sóng 530 nm.
b) Dựng đường chuẩn
+ Xây dựng đường chuẩn glucose với nồng độ từ 5 - 30 µg/µl
+ Dung dịch glucose chuẩn: Pha loãng từ dung dịch gốc với đệm acetate pH 5.0
Thực hiện một loạt 6 ống nghiệm theo bảng sau.
Bảng 2.4: Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucose
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ glucose (µg/µl) 0 5 10 15 20 30 Dung dịch glucose (µl) 0 60 60 60 60 60 Đệm acetate 0.1 M, pH 5.0 (µl) 660 600 600 600 600 600 Dung dịch DNS (µl) 300 300 300 300 300 300 Nước cất (ml) 3 3 3 3 3 3
c) Tiến hành mẫu thí nghiệm: Các bước tiến hành tương tự bảng 2.4, dung dịch glucose chuẩn thay bằng dung dịch mẫu thí nghiệm.
2.2.1.6. Phương pháp xác định thành phần rơm rạ
- Áp dụng phương pháp của nhà máy giấy Đồng Nai TAPPI TEST METHODS. Dùng acid sulfuric 72% 24N để hydro hóa và hòa tan các cacbohydrat trong gỗ; lignin không hòa tan trong axit được lọc và cân
- Cách pha hóa chất:
Axit sulfuric 72% 24N, trọng lượng riêng 1.6338 được chuẩn bị như sau: Rót 665ml acid sulfuric đậm đặc vào 300ml nước, làm lạnh pha thành 1000 ml. Điều chỉnh nồng độ thành 24N bằng cách chuẩn độ với kiềm.
Hỗn hợp ethanol-benzen: 1 thể tích ethanol 95% và 2 thể tích benzene. - Cách tiến hành:
Loại resin: Lấy 2g bột rơm, cho 25 ml hỗn hợp ethanol-benzen vào, để yên trong 30 phút, gạn bỏ hỗn hợp trên, cho thêm 25ml ethanol dể trong 15 phút, gạn bỏ ethanol, rửa lại bằng nước nóng, lọc để loại nước. Bột rơm được sấy khô trong tủ sấy 60ºC.
Cân lấy 1g bột rơm đã loại resin cho vào becher 250ml, cho từ từ 15ml H2SO4
72% vào, dùng đũa khuấy thật kĩ giữ mẫu ở 2ºC cho đến khi tan mẫu. Sau khi mẫu tan, bao miệng becher lại và giữở nhiệt độ thường trong hai giờ. Thường xuyên