Trước khi tiến hành chạy điện di, tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme endoglucanase và β- glucosidase trên môi trường CMC agar vì CMC là cơ chất của endoglucanase. Các bước tiến hành như sau:
Chuẩn bị môi trường CMC agar với 2% CMC và 1.75% agar - Hấp khử trùng
- Đổđĩa, đục lỗ
- Cho 1ml dịch nuôi cấy vào đĩa ủở 370C trong 2 giờ - Nhuộm với Congo red 1% trong 30 phút
- Bỏ Congo red
- Rửa với NaCl 1M trong 15 phút - Xem kết quả
Sau khi kiểm chứng, tiến hành chạy điện di với nguyên tắc và các bước cụ thể như sau
¾ Nguyên tắc
Phương pháp điện di biến tính, các protein được phản ứng với các chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm là SDS để tạo thành một phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về cực dương của điện trường, SDS kết hợp với phần kỵ nước của protein và phá vỡ cấu trúc xoắn làm cho protein trở nên ổn định. Thêm vào đó một chất khử là mercaptoethanol hoặc dithithreiot (DTT) để phá vỡ cầu nối –S-S- (disulfur) của protein (và các tiểu đơn vị của chúng). Nhờđó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein trong cùng một điều kiện chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua lỗ gel có kích thước nhất định.
¾ Chuẩn bị
a) Dung dịch stock
+ 2 M Tris-HCl (pH 8.8), 100 ml: Cân 24.2 g Tris HCl, thêm 50 ml nước khử ion, điều chỉnh về pH 8.8 bằng acid HCl đậm đặc. Định mức với nước thành 100 ml.
+ 1 M Tris-HCl (pH 6.8), 100 ml: Cân 12.1 g Tris base, thêm 50 ml nước khử ion, điều chỉnh về pH 6.8 bằng acid HCl đậm đặc. Định mức với nước thành 100 ml.
+ 10% SDS (w/v), 100 ml, dự trữ ở nhiệt độ phòng: Cân 10 g SDS, hòa tan trong nước và thêm nước thành 100 ml.
+ 50% glycerol (v/v), 100 ml: Đổ 50 ml glycerol 100%, thêm 100 ml nước khử ion.
+ 1% bromophenol blue (w/v), 10 ml: Cân 10 mg bromophenol blue, hòa tan trong 10 ml nước cất, khuấy cho đến khi hòa tan hết. Lọc để loại bỏ thuốc nhuộm còn tủa lại.
b) Dung dịch cho điện di biến tính
+ Dung dịch A ( Dung dịch Acrylamide chuẩn), 100 ml 30% (w/v) acrylamide, 0.8% (w/v) bis- acrylamide
• Acrylamide : 29.2 g
• Bis- acrylamide : 0.8 g Hòa tan bằng nước cất, định mức đến 100 ml + Dung dịch B (4x separating gel buffer), 100 ml
• 2 M Tris-HCl (pH 8.8) : 75 ml
• 10% SDS : 4 ml
• Nước khử ion : 21 ml + Dung dịch C (4x stacking gel buffer), 100 ml
• 1 M Tris-HCl (pH 6.8) : 50 ml • 10% SDS : 4 ml • Nước khử ion : 46 ml + 10% ammonium persulfate , 5 ml • Ammonium persulfate : 0.5 g • Nước khử ion : 5 ml + Đệm chạy điện di, 1 lít • Tris base : 3 g • Glycine : 14.4 g • SDS : 1 g • Nước khử ion : 1 lít • pH khoảng : 8.3 + Sample buffer 5x, 10 ml • 1 M Tris-HCl (pH 6.8) : 0.6 ml • 50% glycerol : 5 ml • 10% SDS : 2 ml • 2-mercaptoethanol : 0.5 ml
• 1% bromophenol blue : 1 ml + Dung dịch nhuộm Coomasie Blue
• Coomasie Blue R-250 : 1 g • Methanol : 450 ml • Acid acetic đậm đặc : 100 ml • Nước khử ion : 450 ml + Dung dịch giải nhuộm • Methanol : 100 ml • Acid acetic đậm đặc : 100 ml • Nước khử ion : 800 ml ¾ Tiến hành Chuẩn bị gel
+ Dung dịch separating gel 12%
• Dung dịch A : 4 ml
• Dung dịch B : 2.5 ml
• Nước khử ion : 3.445 ml
• TEMED : 5 µl
• Ammonium persulfate 10% : 50 µl + Dung dịch stacking gel 5%
• Dung dịch A : 0.67 ml
• Dung dịch C : 1 ml
• Nước khử ion : 2.3 ml
• TEMED : 5 µl
• Ammonium persulfate 10% : 30 µl
+ Chuẩn bị mẫu protein: Pha mẫu + Sample buffer 5x trong 1 eppendort (20 µl mẫu + 5 µl Sample buffer) đun cách thủy (100oC, 2–10 phút) ly tâm (15000 vòng/phút, trong 1 phút).
Chuẩn bị gel
Đổ separating gel
Đổ stacking gel
(Sau khi gel polymer hóa, 30- 60 phút)
Chèn lược vào khuôn gel (tránh xuất hiện bóng khí) Để gel polymer hóa khoảng 30 phút (gel đông)
Rút lược, chuyển đĩa gel vào đệm điện di
buồng điện di
Chuẩn bị mẫu Bơm mẫu vào giếng
Chạy điện di gel biến tính
Nhuộm gel với Coomasie Blue (30 phút, trên máy lắc nhẹ)
Bỏ nhuộm, rửa với nước cất vài lần
Ghi nhận kết quả