phân bằng enzyme cellulase.
Trong đề tài này, tôi không đi sâu vào việc kiểm tra điều kiện và nồng độ
enzyme tối ưu cho việc thủy phân nguyên liệu đã qua xử lý mà chỉ sử dụng một Nguyên liệu tươi Phơi khô Nghiền nhỏ Dung dịch NH4OH 10% Dung dịch H2O2 30% Thu hồi NH4OH Lọc Thủy phân Lên men Ethanol Xylitol Nguyên liệu tươi
67
nồng độ ngẫu nhiên để kiểm tra hiệu quả thủy phân nguyên liệu sau xử lý và trước khi xử lý nhằm mục đích xác định hiệu quả của việc tiền xử lý.
Bảng 4.14. Kết quả hàm lượng glucose tạo thành sau thủy phân Glucose( mg/ml) tại 48h thủy phân
Nguyên liệu chưa tiền xử lý Nguyên liệu đã tiền xử lý
Không enzyme Có enzyme Không enzyme Có enzyme
0,35±0,13 3,23±0,15 0,36±0,09 6,12±0,18
Hình 4.4. Ảnh chụp quá trình thủy phân nguyên liệu bằng enzyme cellulase sau 24 giờ
Qua các kết quả trên thấy, nguyên liệu sau khi tiền xử lý thì hiệu quả thủy phân tăng lên rõ rệt. Đường glucose thu được của nguyên liệu đã qua tiền xử lý là: 6,121mg/ml >3,230 mg/ml của nguyên liệu không qua tiền xử lý. Mặt khác qua hình 4.4 nhận thấy rõ trong ống nghiệm đựng nguyên liệu đã qua tiền xử lý còn lại rất ít, còn trong ống nghiệm nguyên liệu chưa tiền xử lý thì còn rất nhiều. Như vậy, việc tiền xử lý kết hợp theo quy trình rút ra mang lại những hiệu quả tích cực trong việc loại bỏ lignin cũng như trong quá trình thủy phân bằng enzyme cellulase.
Nguyên liệu đã xử lý
Nguyên liệu chưa xử lý
68
4.4. Thu nhận enzyme cellulase và kiểm tra trên cơ chất đã qua tiền xử lý.
Như đã đề cập ở trên, giai đoạn thủy phân nguyên liệu bằng enzyme cellulase là một giai đoạn hết sức quan trọng trong quá trình tạo cồn. Hiện nay lượng enzyme thương phẩm thường do các công ty đa quốc gia nắm giữ, nên vấn đề
giá cả cũng là trở ngại lớn cho việc sản xuất nhiên liệu từ sinh khối. Chính vì vậy để
chủđộng nguồn enzyme này tôi thực hiện việc phân lập tuyển chọn các chủng VSV có khả năng phân hủy cellulose và bước đầu thu nhận enzyme cellulase đểứng dụng vào thủy phân nguồn nguyên liệu đã qua tiền xử lý.
Tôi đã phân lập được một số mẫu nấm có khả năng phân hủy cellulose. Trong số này có 10 chủng cho kết quả cao hơn những chủng còn lại.
Bảng 4.15. Hoạt độ 10 chủng có hoạt tính enzyme cellulase cao Hoạt tính cellulase thủy phân cơ chất CMC (UI/ml)
Ngày LS 3 LS 9 BR 3 GL 4 GL7 TB5 ĐL22 LS 24 BR96 GL54 1 0,30 0,40 0,36 0,34 0 0 0,32 0,37 0 0,21 2 0,34 0,35 0,36 0,34 0,27 0,38 0,32 0,35 0,28 0,28 3 0,37 0,44 0,31 0,32 0,25 0,38 0,34 0,26 0,28 0,33 4 0,36 0,49 0,25 0,31 0,27 0,38 0,29 0,31 0,33 0,32 5 0,37 0,41 0,39 0,28 0,34 0,38 0,10 0,29 0,33 0,34 6 0,36 0,48 0,37 0,33 0,29 0,33 0,22 0,29 0,34 0,30 7 0,36 0,50 0,35 0,37 0,36 0,38 0,34 0,31 0,35 0,29 8 0,36 0,47 0,34 0,36 0,02 0,38 0,27 0,30 0,34 0,29 9 0,36 0,48 0,33 0,33 0,02 0,40 0,37 0,31 0,31 0,28 10 0,35 0,47 0,33 0,36 0,04 0,38 0,39 0,30 0,35 0,29 11 0,34 0,49 0,33 0,35 0,09 0,38 0,37 0,31 0,35 0,26 12 0,35 0,46 0,33 0,33 0,13 0,37 0,37 0,32 0,35 0,26 13 0,34 0,48 0,33 0,38 0,17 0,38 0,36 0,31 0,36 0,24 14 0,34 0,47 0,35 0,35 0,20 0,36 0,37 0,28 0,36 0,25
69
Theo bảng 4.15 nhận thấy chủng LS 9 được thu mẫu ở Lạng Sơn là chủng có hoạt tính của enzyme cellulase mạnh nhất và ổn định trong 14 ngày theo dõi. Do đó tôi chọn chủng LS -9 để nuôi cấy và thu nhận enzyme.
Hình 4.5. Hình ảnh chủng LS9 sau 4 ngày trên môi trường Czapek- Dox
Khi quan sát chủng nấm LS9 dưới kính hiển vi nhận thấy các đặc điểm sau: Khuẩn lạc: Tròn, dạng bông xồm mang các đám bào tử từng khối. Lúc đầu thấy có màu xanh nhạt, sau dần chuyển sang xanh đậm.
Hình thái vi thể: Sợi nấm có ngăn vách trong suốt. Cuống sinh bào tử phân nhánh dạng nhánh cây nhiều 2-3 lần, các nhánh cụm lại 2, 3 hoặc đơn độc. Bào tử
hình cầu, oval, vách có gai rõ. Thể bình hình chai, cổ thóp rõ.
Với các đặc điểm này có thể nhận định đây có thể là nấm Trichoderma.
Sau khi nuôi cấy được 66h tôi tiến hành thu enzyme và xác định hoạt tính của enzyme cellulase và so sánh giữa các môi trường nuôi cấy.
Bảng 4.16. Hoạt độ của enzyme cellulase thu nhận từ chủng LS9 nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy OD0 ODT pha loãng 40 lần ΔOD Hoạt
độ UI/g TN1 TN2 TN3 TB Cám + trấu 0,430 0,931 0,932 0,931 0,931 0,501 3,89 Cám + Cỏ VA06 8:2 0,430 2,220 2,220 2,220 2,220 1,790 13,94 6:4 0,430 2,425 2,425 2,426 2,425 1,995 15,53 5:5 0,430 2,112 2,113 2,112 2,112 1,680 13,07 4:6 0,430 2,110 2,111 2,110 2,110 1,680 13,07
70
Qua bảng 4.16 thấy, trong môi trường bán rắn cơ bản chủng LS9 cho enzyme cellulase có hoạt tính 3,89 UI/g. Khi thay trấu bằng cỏ VA06 xay nhỏ thì hoạt tính cellulase tăng mạnh và đạt cao nhất trong môi trường cám với cỏ VA06 tỷ lệ 6:4 đạt 15,53 UI/g. Enzyme cellulase là enzyme cảm ứng, theo Nguyễn Văn Vinh (2011) thì trấu có hàm lượng holocellulose chiếm 71,72%, lignin 36,89%. Lượng lignin tương đối cao hơn so với cỏ VA06 (lignin chiếm 15,93%) nên hạn chế sự cảm ứng của enzyme cellulase lên cellulose có trong trấu vì vậy hoạt tính của enzyme cellulase trong môi trường cám và trấu thấp hơn so với môi trường cám và cỏ
VA06. Từ đó tôi chọn môi trường cám có bổ sung cỏ VA06 theo tỷ lệ 6:4 để nuôi chủng LS9 và xác định hoạt độ enzyme cellulase tại các thời điểm 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72h sau khi nuôi cấy.
Bảng 4.17. Sự biến đổi hoạt độ của cellulase thu nhận từ chủng LS9 trong môi trường cám bổ sung cỏ VA06 tỷ lệ 6:4 theo thời gian
Qua bảng 4.17 nhận thấy, hoạt độ cellulase chủng LS9 tăng chậm tới 42 giờ
sau đó thì tăng nhanh và đạt cực đại tại 66 giờ thu được hoạt độ 15,53 UI/g canh trường. Sau 66 giờ thì hoạt độ cellulase giảm.
Như vậy chủng LS9 được nuôi cấy trong môi trường cám có bổ sung cỏ
VA06 theo tỷ lệ 6:4 và sau khi nuôi cấy được 66 giờ là tiến hành canh trường thì thu được hoạt độ cellulase cao nhất 15,53 UI/g canh trường.
Môi trường nuôi cấy OD0 ODT pha loãng 40 lần ΔOD Hoạt
độ UI/g TN1 TN2 TN3 TB Thời gian nuôi cấy (giờ) 36 0,430 1,231 1,230 1,230 1,231 0,801 6,24 42 0,430 1,420 1,420 1,421 1,420 0,990 7,73 48 0,430 1,845 1,845 1,846 1,845 1,451 11,33 54 0,430 2,012 2,013 2,012 2,012 1,582 12,32 60 0,430 2,217 2,217 2,216 2,217 1,787 13,91 66 0,430 2,425 2,425 2,426 2,425 1,995 15,53 72 0,430 2,373 2,374 2,374 2,374 1,944 15,22
71
Với điều kiện này khi tiến hành canh trường thu enzyeme được hàm lượng tổng protein 28,7 mg/g canh trường.
Bảng 4.18. Hàm lượng protein trong canh trường nuôi cấy chủng LS9
Chủng LS9 khi được nuôi trong môi trường cám bắp có bổ sung cỏ VA06 cho hàm lượng protein là 28,7 mg/g, và hoạt độ enzyme cellulase là 15,53 UI/g. Kết quả này cao hơn so với kết quả của Lê Thị Hồng Nga khi nuôi Trichoderma reesei
trong môi trường cám có bổ sung bã mía đạt hàm lượng protein là 24,82 mg/g canh trường và hoạt độ cellulase là 7,42 UI/g[3].
Bảng 4.19. Hàm lượng đường từ sự thủy phân nguyên liệu bằng enzyme thu nhận từ canh trường chủng LS9
Đường tổng( mg/ml) tại thời điểm 48h thủy phân Chưa xử lý Đã xử lý
Không enzyme Có enzyme Không enzyme Có enzyme
0,29 2,53 0,30 5,81 Khi so sánh kết qủa của sự thủy phân enzyme thu nhận từ chủng LS9 so với nguồn enzyme của hãng Sigma thì hàm lượng đường thấp hơn ( 5,81 < 6,12 mg/ml).
Môi trường nuôi cấy OD0 ODT pha loãng 40 lần ΔOD HL prot mg/g TN1 TN2 TN3 TB
72
Chương 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. Kết luận.
Từ các kết quả của các thí nghiệm tôi rút ra một số kết luận sau:
- Hàm lượng holocellulose trong một số loại cỏ nghiên cứu trong đề tài được tạm chia thành hai nhóm:
+ Nhóm có hàm lượng holocellulose cao hơn gồm các cây thuộc họ hòa thảo (cỏ sậy, cỏđuôi chồn, cỏ voi, cỏ VA06) và cỏ vertiver, hàm lượng holocellulose đạt từ 65 -71%. Cao nhất trong nhóm này là ở cỏ sậy 70,30%. Bên cạnh đó hàm lượng lignin của nhóm này thấp hơn, trung bình chiếm từ 14 – 18% hàm lượng chất khô.
+ Nhóm có hàm lượng holocellulose thấp hơn là lục bình với hàm lượng holocellulose là 52,10%. Hàm lượng lignin cao nhất chiếm 23,46 % hàm lượng chất khô.
- Khi xử lý kết hợp các hóa chất cho hiệu quả loại bỏ lignin cao hơn khi dùng riêng lẻ. Với NH4OH 10%, ở 600C trong 8h loại bỏđược 20,14 % lignin, H2O2 loại bỏđược 26,47 % trong 12 giờ xử lý còn khi kết hợp H2O2 với NH4OH theo tỷ lệ 1:2 loại bỏđược 54,67% lignin trong lignocellulose.
- Hiệu quả thủy phân khi xử lý nguyên liệu theo quy trình làm tăng lượng
đường thu được lên gấp đôi. Nguyên liệu đã xử lý khi cho thủy phân thu được 6,121 mg/ml glucose, còn nguyên liệu chưa xử lý sau khi thủy phân thu được 3,230 mg/ml glucose.
- Qua phân lập và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng phân hủy được cellulose, trong đó chủng LS 9 có hoạt tính cellulase cao nhất. Khi canh trường và thu enzyme được hoạt độ enzyme cellulase 15,53 UI/g. Sử dụng enzyme thu nhận
được thủy phân nguyên liệu đã qua xử lý thu được 5,813 mg/ml đường tổng.
5.2. Kiến nghị.
- Cần nghiên cứu kỹ về các loại cỏ khác để xác định các loại có hàm lượng cellulose cao làm nguyên liệu để sản xuất nhiên liệu sinh học.
73
- Tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện quy trình tiền xử lý, cải thiện hệ thống thu hồi khí NH3.
- Kiểm tra quy trình trên một số phụ phẩm nông nghiệp khác như: rơm rạ, trấu…và phụ phẩm công nghiệp như: mùn cưa…
- Dùng kỹ thuật đánh dấu Maule histochemical, chụp laser và hiển vi khác để
nghiên cứu về cơ chế loại bỏ lignin trong quá trình tiền xử lý.