hợp lên hàm lượng lignin và cellulose trong cỏ VA06.
3.5.2.1. Mục đích:
- Loại bỏđược lượng lignin nhiều nhất. - Giữđược lượng holocellulose cao nhất. - Chi phí thực hiện thấp nhất.
3.5.2.2. Cách tiến hành:
Chọn cỏ VA06 làm đối tượng thí nghiệm vì đặc tính sinh trưởng tốt trên nhiều loại môi trường đất và năng suất sinh khối cao, hàm lượng cellulose cao.
a. Thí nghiệm 2.1: Khảo sát sự tác động của vi sóng lên các thành phần nguyên liệu.
Cách tiến hành: Lấy 3g mẫu đã sấy tới khối lượng không đổi ở 1050C cho vào bình tam giác 150 ml bổ sung 30ml H2O. Sau đó cho vào lò vi sóng và thực hiện chiếu sóng với các thời gian như sau: 1 phút, 3 phút, 5 phút, 7 phút.
Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên cho thí nghiệm 1 yếu tố là nồng độ thời gian chiếu vi sóng, thí nghiệm được bố trí với với các điểm thời gian là: 0 phút, 1 phút, 3 phút, 5 phút, 7 phút (kí hiệu T0: 0phút; T1: 1 phút, T2: 3 phút, T3: 5 phút, T4: 7 phút).
Yếu tố cường độ chiếu vi sóng, thí nghiệm được bố trí với một mức là:5 phút kí hiệu là W
43
Như vậy thí nghiệm có 5 nghiệm thức với 3 lần lặp lại Tổng cộng: 5NT * 3 = 15 bình thí nghiệm
Các chỉ tiêu theo dõi
- Xác định hàm lượng tro, lignin, cellulose sau quá trình tiền xử lý. - So sánh hàm lượng lignin, cellulose sau và trước quá trình tiền sử lý
b. Thí nghiệm 2.2: Khảo sát sự tác động của các nồng độ NH4OH lên các thành phần nguyên liệu với các mức nhiệt độ khác nhau.
Cách tiến hành: Lấy 3g mẫu đã sấy tới khối lượng không đổi ở 1050C cho vào bình tam giác 150 ml bổ sung 30ml NH4OH với các nồng độ: 0%, 5%, 10%, 15%, 20%. Sau đó cho vào tủ ủ nhiệt với các mức nhiệt độ sau: 300C, 500C, 600C, 700C và thực hiện trong thời gian 8 giờ.
Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên cho thí nghiệm 2 yếu tố:
Yếu tố thứ nhất là nồng độ NH4OH sử dụng với 4 nồng độ là 0%; 10% ; 15% ; 20% (kí hiệu N0: 0%NH4OH; N1: 10% NH4OH, N2: 15% NH4OH, N3: 20% NH4OH).
Yếu tố thứ 2 là yếu tố nhiệt độ xử lý với các mức nhiệt độ 300C; 600C; 700C; 800C (kí hiệu: T0: 300C (nhiệt độ phòng); T1: 600C; T2: 700C; T3: 800C).
Như vậy thí nghiệm có 16 nghiệm thức với 3 lần lặp lại Tổng cộng: 16NT * 3 = 48 bình
Các chỉ tiêu theo dõi
- Xác định hàm lượng tro, lignin, cellulose sau quá trình tiền xử lý. - So sánh hàm lượng lignin, cellulose sau và trước quá trình tiền sử lý.
c. Thí nghiệm 2.3: Khảo sát sự tác động của H2O2 lên các thành phần nguyên liệu.
Cách tiến hành: Lấy 3g mẫu đã sấy tới khối lượng không đổi ở 1050C cho vào bình tam giác 150 ml bổ sung 30ml H2O2 30%. Sau đó đểở nhiệt độ phòng với các thời gian như sau: 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ.
44
Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên cho thí nghiệm 1 yếu tố là thời gian xử lý, thí nghiệm được bố trí với với các thời gian là: 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ
(kí hiệu T1: 6 giờ, T2: 12 giờ, T3: 18 giờ).
Yếu tố nồng độ và nhiệt độ không đổi kí hiệu là N Như vậy thí nghiệm có 3 nghiệm thức với 3 lần lặp lại
Tổng cộng: 3NT * 3 =9 bình thí nghiệm
Các chỉ tiêu theo dõi
- Xác định hàm lượng tro, lignin, cellulose sau quá trình tiền xử lý. - So sánh hàm lượng lignin, cellulose sau và trước quá trình tiền sử lý.
d. Thí nghiệm 2.4: Khảo sát sự tác động kết hợp của vi sóng và NaCl lên các thành phần nguyên liệu.
Cách tiến hành: Lấy 3g mẫu đã sấy tới khối lượng không đổi ở 1050C cho vào bình tam giác 150 ml bổ sung 30ml dung dich NaCl với các nồng độ: 1%, 3% 5%, 7%. Sau đó cho vào lò vi sóng và thực hiện chiếu sóng với các thời gian như
sau: 1 phút, 3 phút, 5 phút, 7 phút.
Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên cho thí nghiệm 2 yếu tố:
Yếu tố thứ nhất là nồng độ NaCl sử dụng với 4 nồng độ là 1%; 3% ; 5% ; 7% (kí hiệu N1: 1%; N2: 3%, N3: 5%, N4: 7%). Yếu tố thứ 2 là yếu tố thời gian xử lý vi sóng với các mức thời gian1 phút; 3 phút; 5 phút; 7 phút (kí hiệu: T1: 1 phút; T2: 3 phút; T3: 5 phút; T4: 7 phút). Như vậy thí nghiệm có 16 nghiệm thức với 3 lần lặp lại Tổng cộng: 16NT * 3 = 48 bình
Các chỉ tiêu theo dõi
- Xác định hàm lượng tro, lignin, cellulose sau quá trình tiền xử lý. - So sánh hàm lượng lignin, cellulose sau và trước quá trình tiền sử lý.
e. Thí nghiệm 2.5: Khảo sát sự tác động kết hợp giữa NH4OH và H2O2 lên các thành phần nguyên liệu.
45
Cách tiến hành: Lấy 3g mẫu đã sấy tới khối lượng không đổi ở 1050C cho vào bình tam giác 250 ml bổ sung 40ml hỗn hợp dung dich NH4OH và H2O2 theo tỷ
lệ sau: 2:1, 1:1, 1:2. Sau đó để trong giờ kết thúc phản ứng. Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên . Như vậy thí nghiệm có 3 nghiệm thức với 3 lần lặp lại
Tổng cộng: 3NT * 3 = 9 bình thí nghiệm
Các chỉ tiêu theo dõi
- Xác định hàm lượng tro, lignin, cellulose sau quá trình tiền xử lý. - So sánh hàm lượng lignin, cellulose sau và trước quá trình tiền sử lý
f. Thí nghiệm 2.6: Khảo sát sự tác động kết hợp giữa NaCl, vi sóng và NH4OH lên các thành phần nguyên liệu.
Cách tiến hành: Lấy 3g mẫu đã được xử lý tại nồng độ NaCl 3% và thời gian chiếu sóng là 5 phút và sấy tới khối lượng không đổi ở 1050C cho vào bình tam giác 150 ml bổ sung 30ml NH4OH 10%. Sau đó cho vào tủủ 600C trong các khoảng thời gian là 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ.
Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên cho thí nghiệm 1 yếu tố là thời gian thực hiện, thí nghiệm được bố trí với với các thời gian là: 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ (kí hiệu T1: 3 giờ, T2: 6 giờ, T3: 9 giờ, T4: 12 giờ).
Yếu tố cường độ chiếu vi sóng, thời gian chiếu sóng, nồng độ NH4OH được chọn thích hợp theo những khảo sát ở trên kí hiệu là N.
Như vậy thí nghiệm có 4 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. Tổng cộng: 4NT * 3 = 12 bình thí nghiệm.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Xác định hàm lượng tro, lignin, cellulose sau quá trình tiền xử lý. - So sánh hàm lượng lignin, cellulose sau và trước quá trình tiền sử lý.
g. Thí nghiệm 2.7: Khảo sát sự tác động kết hợp giữa NaCl, vi sóng và H2O2 lên các thành phần nguyên liệu.
Cách tiến hành: Lấy 3g mẫu đã được xử lý tại nồng độ NaCl 3% và thời gian chiếu sóng là 3 phút và sấy tới khối lượng không đổi ở 1050C cho vào bình tam giác
46
150 ml bổ sung 30ml H2O2 30%. Sau đó đểở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian là 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ.
Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên cho thí nghiệm 1 yếu tố là thời gian thực hiện, thí nghiệm được bố trí với với các thời gian là: 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ (kí hiệu T1: 3 giờ, T2: 6 giờ, T3: 9 giờ, T4: 12 giờ).
Yếu tố cường độ chiếu vi sóng, thời gian chiếu sóng, nồng độ H2O2 được chọn thích hợp theo những khảo sát ở trên kí hiệu là N.
Như vậy thí nghiệm có 4 nghiệm thức với 3 lần lặp lại. Tổng cộng: 4NT * 3 = 12 bình thí nghiệm.
Các chỉ tiêu theo dõi
- Xác định hàm lượng tro, lignin, cellulose sau quá trình tiền xử lý. - So sánh hàm lượng lignin, cellulose sau và trước quá trình tiền sử lý.
h. Chụp kính hiển vi điện tử nguyên liệu sau khi được xử lý
Nguyên liệu sau khi kết thúc giai đoạn tiền xử lý, và mẫu chưa được xử lý
được xấy khô ở 900C trong 6 giờ. Sau đó làm nguội bằng bình hút ẩm. Đến khi nguyên liệu nguội thì cân mỗi mẫu 5g đóng trong lọ nhựa 10ml, nắp được gắn parapin. Trên mỗi lọ nhựa có ghi thông tin về mẫu như: tên mẫu, cách xử lý.
Mẫu được gửi sang Hàn Quốc chụp KHVĐT ở các mức phóng đại: 40,100, 500, 1.000, 3.000, 6.000, 10.000 lần để quan sát cấu trúc của nguyên liệu trước và sau tiền xử lý.
3.5.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát hàm lượng glucose tạo thành từ nguyên liệu đã qua tiền xử lý bằng enzyme cellulase dùng trong phân tích.
3.5.3.1. Mục đích
Kiểm tra khả năng thủy phân của enzyme trên cơ chất đã qua sử lý và so sánh với lượng glucose trong mẫu được xử lý với mẫu chưa được xử lý.
3.5.3.2. Cách thức tiến hành
Bước 1: Pha enzyme cellulase hoạt độ 1.2UI/mg ở nồng độ 0,01% trong buffer citratphosphat pH 4,8
47
Bước 2: Cân 20mg mẫu đã qua tiền xử lý vào ống nghiệm 10ml. Đối với nguyên liệu chưa xử lý cân 30mg.
Bước 3: Cho 2ml buffer citratphosphat có chứa enzyme hoạt độ 0.24 UI. Bước 4: Cho vào tủủở 500C.
Bước 5: Kiểm tra nồng độđường tạo thành sau: 48h.
Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng đường được đo bằng phương pháp DNS
3.5.4. Thí nghiệm 4: Thu nhận chế enzyme cellulase và kiểm tra trên cơ chất
đã qua tiền xử lý. 3.5.4.1. Mục đích
Trong sản xuất NLSH từ nguồn sinh khối thì vấn đề quan trọng nhất quyết
định tới thành bại của quy trình là việc tiền xử lý loại bỏ lignin và nguồn enzyme thủy phân cellulose. Hiện nay trên thị trường nguồn enzyme đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp thường do các công ty đa quốc gia cung cấp nên giá thành bị đẩy lên cao. Do vậy, để chủ động trong quá trình sản xuất tôi thực hiện tuyển chọn các chủng nấm có khả năng phân hủy cellulose và tiến hành canh trường thu enzyme. Công đoạn này được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 11 năm 2010 tới tháng 1 năm 2012, nhằm tuyển chọn các chủng nấm ở Việt Nam có khả
năng thủy phân tốt cellulose. Bước đầu thu nhận enzyme cellulase ứng dụng trong thủy phân nguyên liệu đã qua tiền xử lý.
3.5.4.2. Các công đoạn tiến hành
Giai đoạn 1:
- Thu thập mẫu: Mẫu là rơm, rạ, lá cây, đất mục…được các bạn sinh viên, cùng tôi thu thập theo các địa phương là quê của mỗi người. Sau khi mẫu được thu thập sẽ mang về phòng thí nghiệm để tiến hành tuyển chọn và phân lập các chủng nấm mốc từ các mẫu thu thập được có khả năng phân hủy cellulose cao. Môi trường phân lập và tuyển chọn là môi trường Czapek- Dox[4] .
- NaNO3 : 3,5 g. - K2HPO4 : 1,5 g.
48 - MgSO4.7H2O : 0,5 g. - KCl : 0,5 g. - FeSO4.7H2O : 0,01 g. - Glucoza : 20 g. - Agar : 20 g. - Nước cất : 1000ml. - CMC : 10 g. - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút.
Sau khi tinh sạch tiến hành xác định hoạt tính enzyme cellulase của các chủng nấm thu được trên môi trường Avicel.
- NaNO3 : 3,5 g. - K2HPO4 : 1,5 g. - MgSO4.7H2O : 0,5 g. - KCl : 0,5 g. - FeSO4.7H2O : 0,01 g. - Glucoza : 20 g. - Nước cất : 1000ml. - CMC : 10 g.
- Trace : 1ml/100ml môi trường. - Tween : 1ml/100ml môi trường.
Chọn các chủng nấm có hoạt tính cellulase cao và giữ giống trong môi trường Potato glucose agar (PGA)[4]
- Nước chiết khoai tây : 200 ml.
49
- Glucose : 100g
- Nước cất : 1000 ml.
- pH = 5,5- 6,0. Khử trùng 1atm trong 30 phút
Giai đoạn 2: Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase.
Chọn chủng nấm có hoạt tính enzyme cellulase cao nhất nuôi trong môi trường bán rắn cơ bản là cám, trấu với tỷ lệ 8:2 và các môi trường cám có bổ sung cỏ VA06 xay nhỏ với tỷ lệ 8:2, 6:4, 5:5, 4:6, 2:8. Mật độ bào tử khoảng 106 bào tử/gram môi trường. Sau 3 ngày nuôi cấy thì tiến hành canh trường thu enzyme. Lấy 20g môi trường nuôi cấy nấm sau 3 ngày, thêm vào 50ml nước lắc kỹ. Lọc lấy phần dịch đem li tâm 7000 vòng/ phút trong vòng 15 phút. Thu phần dịch đem kết tủa bằng cồn 960 với tỷ lệ 1:3, lọc tủa đem sấy lạnh. Sau đó pha vào đệm citrate phosphate pH 4.8 và xác định hoạt tính enzyme. Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Lowry.
Giai đoạn 3: Kiểm tra khả năng thủy phân nguyên liệu đã qua xử lý theo quy trình sau.
Bước 1: Pha enzyme cellulase hoạt độ 15.53 UI/g ở nồng độ 0.8 % trong buffer citratphosphat pH 4,8
Bước 2: Cân 20mg mẫu đã qua tiền xử lý vào ống nghiệm 10ml. Đối với nguyên liệu chưa xử lý cân 30mg.
Bước 3: Cho 2ml buffer citratphosphat có chứa enzyme hoạt độ 0.25 UI. Bước 4: Cho vào tủủở 500C.
Bước 5: Kiểm tra nồng độ đường tạo thành sau: 48h bằng phương pháp thử
DNS.
3.5.5 Xử lý số liệu.
50
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
4.1. Hàm lượng các thành phần chính có trong chất khô một số loại cỏ.
Trong cơ thể thực vật nước chiếm khoảng 90 - 95% trọng lượng tươi. Nước trong thực vật tồn tại ở hai dạng:
- Nước tự do hay nước liên kết yếu là nước được rút ra khỏi thực vật nhờ các lực hút nước và có các tính chất của nước thông thường. Nước tự do thường chiếm khoảng 70% lượng nước trong thực vật.
- Nước liên kết chặt là lượng nước còn lại khoảng 30%, tính chất của nước liên kết đã bị biến đổi để thích hợp với các chức năng.
Việc loại bỏ hàm lượng nước để xác định hàm lượng chất khô là công việc
đầu tiên trong việc phân tích các thành phần tiếp theo. Công việc này có ý nghĩa quan trọng trong việc tính toán và ước lượng nguồn nguyên liệu cho quá trình sản xuất cũng như việc tính giá thành nhiên liệu sinh học từ sinh khối cỏ sau này.
Bảng 4.1.Hàm lượng chất khô trong các mẫu cỏ nghiên cứu
STT Tên loại cỏ Hàm lượng chất khô(%) 1 Cỏ Voi (trắng) 18,75±0,17 2 Cỏ Voi (tím) 22,97±0,15 3 Cỏ VA06 22,50±0,13 4 Cỏ Sậy 31,20±0,14 5 CỏĐuôi Chồn 34,89±0,13 6 Cỏ Vertiver 29,94±0,22 7 Bèo Lục Bình 9,95±0,07
Trong bảng 4.1 nhận thấy, hàm lượng chất khô thu được trong các mẫu cỏ
nghiên cứu nằm từ 9 – 35 % trong đó:
- Nhóm có hàm lượng chất khô cao gồm: Cỏ vertiver, cỏ đuôi chồn, cỏ sậy. Hàm lượng chất khô từ 30 -35%.
51
- Nhóm có hàm lượng chất khô trung bình gồm: Cỏ voi (trắng), cỏ voi (tím), cỏ VA06. Hàm lượng chất khô từ 18 - 23%.
- Nhóm có hàm lượng chất khô thấp là bèo lục bình. Có hàm lượng chất khô 9,95 %.
Hàm lượng chất khô phản ánh cấu tạo của thực vật, cũng như khả năng tích lũy lignocellulose trong cấu trúc. Lục bình sống nổi trên mặt nước nên có nhiều khoảng chứa khí trong cuống lá dẫn đến hàm lượng chất khô là thấp nhất.
Trong hàm lượng chất khô của thực vật, hai yếu tố có tính chất quyết định
đến chất lượng của nguyên liệu đó là cellulose và lignin. Bên cạnh đó hemicellulose cũng có vai trò quan trọng trong việc làm giảm giá thành sản xuất ethanol thông qua việc tận thu nguồn đường 5C. Cellulose và hemicellulose liên kết với nhau chặt chẽ được gọi chung là holocellulose. Việc phân tích hàm lượng holocellulose sẽ cho ta biết được tiềm năng về khối lượng sản phẩm có thể thu được sau này. Trong thực vật, lignin là chất keo bảo vệ cấu trúc trước các cuộc tấn công từ bên ngoài, và lignin chính là rào cản lớn trong việc thủy phân cellulose. Hàm lượng lignin cho ta biết cấu trúc của loại thực vật đó chặt chẽ hay lỏng lẻo, dễ để sản xuất nhiên liệu sinh học hay khó. Bảng 4.2 Thành phần chính trong một số loại cỏ nghiên cứu STT Thành phần Tên cỏ Holocellulose (%) Lignin (%) Tro (%) Chất trích ly (%) 1 Cỏ Voi (trắng) 68,70±0,12 16,83±0,07 5,81 6,80