2.3.3.1. Hiệu lực của một số thuốc tẩy giun T. suis cho lợn 2.3.3.2. Độ an toàn của thuốc tẩy giun T. suis cho lợn 2.3.3.2. Độ an toàn của thuốc tẩy giun T. suis cho lợn
2.3.3.3. Bước đầu đề xuất biện pháp phòng trừ tổng hợp bệnh giun tròn Trichocephalus suis cho lợn
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
Mẫu được thu thập tại các nông hộ, các trại chăn nuôi lợn tập thể và gia đình theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc.
- Mẫu phân: Lấy mẫu phân mới thải của lợn các lứa tuổi ở một số xã của huyện Định Hóa, Phú Lương và Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên, mẫu phân lợn gây nhiễm, mẫu phân lợn đối chứng, mẫu phân lợn trước và sau khi sử dụng thuốc điều trị với lượng 20 - 30 gam/mẫu. Để riêng mỗi mẫu phân vào một túi nilon nhỏ, mỗi mẫu đều có nhãn ghi: Tuổi lợn, địa điểm, tình trạng vệ sinh thú y, trạng thái phân, thời gian lấy mẫu, phương thức chăn nuôi (những thông tin này cũng được ghi vào nhật ký đề tài).
- Mẫu máu: Ngày thứ 45 sau gây nhiễm, lấy mẫu máu của lợn ở lô đối chứng và lợn ở lô gây nhiễm giun Trichocephalus suis, mỗi lợn lấy 1 ml.
* Các loại mẫu trên được xét nghiệm ngay trong ngày hoặc xét nghiệm sau khi bảo quản theo quy trình bảo quản mẫu trong nghiên cứu ký sinh trùng thú y.
- Mẫubệnh phẩm: Lấy những đoạn ruột lợn có nhiều giun Trichocephalus suis ký sinh và có bệnh tích đại thể rõ rệt. Bệnh phẩm được cố định trong dung dịch Formol 10%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.2. Phƣơng pháp xét nghiệm mẫu
- Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm giun Trichocephalus suis: Tất cả các mẫu phân đều được xét nghiệm bằng phương pháp Fullerborn với dung dịch muối NaCl bão hòa, tìm trứng giun Trichocephalus suis dưới kính hiển vi (độ phóng đại 100). Những mẫu có trứng giun Trichocephalus suis
đánh giá là có nhiễm, ngược lại là không nhiễm.
- Phương pháp xác định cường độ nhiễm giun Trichocephalus suis: Cường độ nhiễm được xác định bằng phương pháp Mc. Master: Đếm số trứng giun T. suis trong một gam phân bằng buồng đếm Mc. Master (Theo tài liệu của Nguyễn Thị Kim Lan và cs 2008 [18] ).
Quy định các cường độ nhẹ, trung bình, nặng và rất nặng như sau: ≤ 500 trứng/gam phân: Nhiễm nhẹ (+)
> 500 - 800 trứng/gam phân: Nhiễm trung bình (++) > 800 - 1000 trứng/gam phân: Nhiễm nặng (+++) > 1000 trứng/gam phân: Nhiễm rất nặng (++++).
Hình 2.1. Ảnh xét nghiệm phân tìm trứng giun T. suis bằng phƣơng pháp Fullerborn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Quy định về lứa tuổi lợn nghiên cứu
Lợn nghiên cứu được chia làm 5 lứa tuổi: ≤ 1 tháng tuổi
> 1 - 2 tháng tuổi > 2 - 4 tháng tuổi > 4 - 6 tháng tuổi > 6 tháng tuổi
2.4.3. Phƣơng pháp xác định thời gian phát triển và khả năng sống của trứng giun Trichocephalus suis trong phân lợn ở ngoại cảnh
- Lấy phân của những lợn nhiễm giun T. suis nặng cho vào 20 chậu nhựa có đường kính 15 cm và chiều cao 10 cm (mỗi chậu khoảng 400 - 500 g phân và mỗi chậu được coi là 1 mẫu). Trong đó, 10 mẫu được theo dõi ở mùa hè với to
= 32 - 34oC và Ao = 70 - 85%; 10 mẫu được theo dõi ở mùa đông với to = 19 - 21oC và Ao = 50 - 65%.
Hình 2.2. Ảnh thí nghiệm theo dõi sự phát triển và khả năng sống của trứng giun T. suis trong phân lợn ở ngoại cảnh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hàng ngày lấy khoảng 3 - 5 g phân/mẫu, xét nghiệm bằng phương pháp Fullerborn tìm trứng giun T. suis và trứng có chứa ấu trùng gây nhiễm để xác định thời gian trứng phát triển thành trứng có sức gây nhiễm. Đếm số trứng/3 vi trường kính hiển vi và đếm số trứng có sức gây bệnh, từ đó xác định được tỷ lệ và thời gian trứng phát triển thành trứng có sức gây nhiễm.
- Tiếp tục theo dõi thí nghiệm trên trong điều kiện như đã trình bày. Tuy nhiên, do thời gian sống của trứng giun T. suis có sức gây bệnh có thể kéo dài. Vì vậy, khi tất cả trứng đã phát triển thành trứng có sức gây bệnh, cứ 5 ngày xét nghiệm 1 lần để xác định khả năng sống của trứng giun T. suis theo thời gian.
Cách xét nghiệm: Mỗi lần lấy 3 - 5g phân/mẫu, xét nghiệm bằng phương pháp Fullerborn, đếm số trứng có sức gây bệnh/3 vi trường và đếm số trứng chết. Từ đó xác định được tỷ lệ trứng giun T. suis chết theo thời gian theo dõi.
2.4.4. Phƣơng pháp xác định thời gian phát triển và khả năng sống của trứng giun Trichocephalus suis trong đất
- Bố trí 5 lô thí nghiệm là 5 chậu nhựa (kích thước = 30cm, cao 18 cm) chứa cùng một loại đất bề mặt lấy ở cùng một khu vực nhưng có ẩm độ khác nhau: + Lô thí nghiệm 1: Đất có ẩm độ < 10% + Lô thí nghiệm 2: Đất có ẩm độ 10 - 20% + Lô thí nghiệm 3: Đất có ẩm độ 20 - 30% + Lô thí nghiệm 4: Đất có ẩm độ 30 - 40% + Lô thí nghiệm 5: Đất có ẩm độ > 40%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.3. Ảnh thí nghiệm theo dõi sự phát triển và khả năng sống của trứng giun T. suis trong đất ở các ẩm độ khác nhau
Theo Lê Văn Khoa và cs (1999), độ ẩm của đất được xác định như sau: Lấy một lượng 20 - 30g đất sấy 105oC cho đến khi khối lượng giữa các lần cân không đổi thì dừng lại, tính độ ẩm của đất theo công thức:
Wt (%) = (a/b) . 100 a: lượng nước mất sau khi sấy (g) b: khối lượng đất trước khi sấy (g) Wt: độ ẩm của đất (%)
Hàng ngày kiểm tra độ ẩm đất bằng phương pháp cảm quan (quan sát bằng mắt và dùng tay nắm đất để kiểm tra). Duy trì độ ẩm như vậy trong suốt thời gian thí nghiệm (dùng bình phun sương bổ sung nước để duy trì độ ẩm cần thiết).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đặt trứng giun T. suis đã thu nhận từ phân mới thải vào lớp đất bề mặt của các lô thí nghiệm trên. Hàng ngày lấy từ các chậu, mỗi chậu 4 - 5 gam đất bề mặt có trứng giun T. suis, phân lập bằng phương pháp Fullerborn và soi ở độ phóng đại 100 lần để tìm trứng giun T. suis. Đếm số trứng giun T. suis/3 vi trường kính hiển vi và đếm số trứng T. suis có sức gây bệnh, từ đó xác định được tỷ lệ trứng phát triển thành trứng có sức gây bệnh và thời gian phát triển.
- Tiếp tục duy trì các lô thí nghiệm trên. Khi tất cả trứng đã phát triển thành trứng có sức gây bệnh, cứ 5 ngày lấy từ các chậu, mỗi chậu 4 - 5 gam đất bề mặt có trứng giun T. suis, xét nghiệm bằng phương pháp Fullerborn, đếm số trứng có sức gây bệnh/3 vi trường và đếm số trứng chết. Từ đó xác định được tỷ lệ trứng giun T. suis chết theo thời gian theo dõi.
2.4.5. Phƣơng pháp theo dõi tác dụng của một số chất sát trùng đối với trứng giun T. suis
Lấy phân của những lợn nhiễm T. suis nặng cho vào 30 đĩa Petri (mỗi đĩa được coi là 1 mẫu). Dàn mỏng và đều phân trên mặt đĩa.
Sử dụng các chất sát trùng: NaOH - 2%, Formaline 10% và Haniodine 10% xịt vào các mẫu trên. Mỗi chất sát trùng sử dụng cho 10 mẫu.
Đếm số trứng/3 vi trường kính hiển vi của tất cả các mẫu trước khi phun chất sát trùng và đếm số trứng chết/3 vi trường kính hiển vi của các mẫu sau khi phun ở các thời điểm: Ngày thứ 1, 3, 6, 9 và 12.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.4. Ảnh thử nghiệm tác dụng của chất sát trùng đối với trứng giun T. suis
2.4.6. Phƣơng pháp gây nhiễm cho lợn
* Phương pháp bố trí thí nghiệm
Chọn 10 lợn con 1 tháng tuổi khỏe mạnh từ trại có điều kiện chăn nuôi tốt, lợn mẹ khỏe và không bị nhiễm giun T. suis và các ký sinh trùng khác. Mỗi lợn được nhốt riêng trong một ô chuồng.
Trước khi gây nhiễm theo dõi trong 1 tuần về tình trạng sức khỏe, đồng thời xét nghiệm phân từng lợn để đảm bảo chắc chắn lợn khỏe và không nhiễm giun sán.
Chia 10 lợn thành 2 lô: Lô thí nghiệm 5 con và lô đối chứng 5 con. Lô 1(Thí nghiệm): Gây nhiễm qua đường tiêu hóa, cho lợn nuốt trứng giun T. suis có sức gây bệnh với 5 liều khác nhau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Phương pháp xác định số lượng trứng gây nhiễm
Sau khi thu nhận trứng giun T. suis có sức gây bệnh từ phân lợn, chúng tôi cho vào ống nghiệm có vạch ml (loại ống nghiệm 15 ml) rồi thêm nước lã tới vạch 11 ml. Dùng đũa thủy tinh nhẹ nhàng khuấy đều nước trong ống, rồi dừng lại đột ngột, lấy công tơ hút 3 lần, mỗi lần 1 ml, rồi đếm số trứng giun T. suis
trong mỗi ml này. Tính số trứng T. suis bình quân trong 1 ml. Từ đó tính liều gây nhiễm cho lợn.
Lợn số 1: Cho nuốt 18900 trứng T. suis có sức gây bệnh. Lợn số 2: Cho nuốt 15300 trứng T. suis có sức gây bệnh. Lợn số 3: Cho nuốt 10800 trứng T. suis có sức gây bệnh. Lợn số 4: Cho nuốt 8100 trứng T. suis có sức gây bệnh. Lợn số 5: Cho nuốt 2700 trứng T. suis có sức gây bệnh.
Lô STT lợn gây nhiễm Tuổi lợn (ngày) Khối lƣợng lợn (kg) Giống lợn Kết quả xét nghiệm giun sán trƣớc gây nhiễm Số lƣợng trứng gây nhiễm Lô lợn gây nhiễm 1 32 6,3 ♂ Landrace x ♀ Móng cái - 18900 2 32 6,1 ♂ Landrace x ♀ Móng cái - 15300 3 32 5,6 ♂ Landrace x ♀ Móng cái - 10800 4 32 5,9 ♂ Landrace x ♀ Móng cái - 8100 5 32 5,4 ♂ Landrace x ♀ Móng cái - 2700 Lô lợn đối chứng 5 32 5,84 ± 0,28 ♂ Landrace x ♀ Móng cái - 0
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sau khi gây nhiễm, mỗi lợn được nuôi riêng trong một ô chuồng nền xi măng, cách ly hoàn toàn, thức ăn không có thuốc phòng, chống giun T. suis. Lô đối chứng (5 con) cũng được nuôi trong điều kiện tương tự.
Hình 2.6. Ảnh gây nhiễm trứng giun T. suis cho lợn
Hàng ngày, lấy mẫu phân tươi của lợn ở cả hai lô để xét nghiệm trứng giun T. suis, theo dõi biểu hiện lâm sàng, theo dõi thời gian thải trứng và số lượng trứng giun T. suis thải ra trong 1 gam phân.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.4.7. Phƣơng pháp theo dõi các biểu hiện lâm sàng bệnh Trichocephalus suis ở lợn gây nhiễm
Phương pháp chủ yếu là quan sát những biểu hiện của lợn: Thể trạng, niêm mạc, phân, ăn uống, vận động.
2.4.8. Phƣơng pháp xét nghiệm máu để xác định một số chỉ số huyết học của lợn khỏe và lợn bị bệnh giun Trichocephalus suis do gây nhiễm
- Số lượng hồng cầu, bạch cầu, hàm lượng huyết sắc tố được xác định bằng máy Osmetech OPTI - CCA/ Blood gas Analyzen.
- Công thức bạch cầu được xác định bằng phương pháp Tristova: Làm tiêu bản máu, nhuộm Giemsa, đếm số lượng từng loại bạch cầu và tính tỷ lệ % từng loại.
2.4.9. Phƣơng pháp xác định bệnh tích đại thể và vi thể
* Phương pháp xác định bệnh tích đại thể:
Mổ khám những lợn bị bệnh Trichocephalus suis ở ngày thứ 60 sau khi gây nhiễm, quan sát bằng mắt thường và kính lúp các phần của ruột, tìm giun
T. suis và chụp ảnh những vùng có bệnh tích điển hình.
* Phương pháp xác định bệnh tích vi thể:
Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể bằng phương pháp làm tiêu bản tổ chức học theo quy trình tẩm đúc parafin, nhuộm Hematoxilin - Eosin, đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học Labophot - 2 và chụp ảnh bằng máy ảnh gắn trên kính hiển vi.
Phương pháp làm tiêu bản vi thể các phần của ruột già lợn theo thứ tự các bước sau:
+ Lấy bệnh phẩm: Cắt các phần ruột già lợn có nhiều giun T. suis ký sinh. + Cố định bệnh phẩm bằng dung dịch Formol 10%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Khử nước: Dùng cồn tuyệt đối để rút nước từ trong bệnh phẩm ra. + Làm trong tiêu bản: Ngâm bệnh phẩm qua hệ thống Xylen để làm trong bệnh phẩm.
+ Tẩm parafin: Ngâm bệnh phẩm đã làm trong vào các cốc đã đựng parafin nóng chảy, để ở tủ ấm nhiệt độ 56o
C.
+ Đổ block: Rót parafin nóng chảy vào khuôn giấy rồi đặt miếng tổ chức bệnh phẩm đã tẩm parafin vào. Khi parafin đông đặc hoàn toàn thì bóc khuôn. Sửa lại block cho vuông vắn.
+ Cắt và dán mảnh: Cắt bệnh phẩm trên máy cắt Microtocom, độ dày mảnh cắt 3 - 4 µm. Dán mảnh cắt lên phiến kính bằng dung dịch Mayer (lòng trắng trứng 1 phần, glyxerin 1 phần, 1 ml hỗn hợp trên pha trong 19 ml nước cất).
+ Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxilin - Eosin.
+ Gắn lamen bằng Balm canada, dán nhãn và đọc kết quả dưới kính hiển vi.
2.4.10. Phƣơng pháp theo dõi hiệu lực tẩy giun T. suis của thuốc Hanmectin - 25; Ivocip và Levamisol
Sử dụng thuốc Hanmectin - 25; Ivocip và Levamisol tẩy giun T. suis cho những lợn nhiễm giun T. suis. Sau khi sử dụng thuốc 15 ngày, xét nghiệm lại phân của những lợn đã được dùng thuốc bằng phương pháp Fullerborn và buồng đếm Mc. Master. Nếu không tìm thấy trứng giun T. suis trong phân thì xác định thuốc có hiệu lực triệt để. Nếu vẫn thấy trứng giun T. suis nhưng số lượng trứng giảm rõ rệt thì xác định thuốc có hiệu lực với giun T. suis nhưng chưa triệt để. Nếu thấy số lượng trứng vẫn không giảm so với trước khi dùng thuốc hoặc giảm không đáng kể thì xác định thuốc không có hiệu lực với giun
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.8. Ảnh thuốc tẩy giun T. suis cho lợn
Xác định độ an toàn của thuốc bằng cách theo dõi trạng thái sinh lý của lợn và các phản ứng phụ trước và sau khi dùng thuốc. Các chỉ tiêu theo dõi chủ yếu gồm: Ăn uống, vận động, da và niêm mạc, các phản ứng phụ khác.
2.5. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 2.5.1. Một số công thức tính tỷ lệ (%) Tỷ lệ nhiễm (%) = Số lợn nhiễm 100 Số lợn kiểm tra Tỷ lệ cường độ nhiễm (%) =
Số lợn nhiễm ở mỗi cường độ
100 Tổng số lợn nhiễm
2.5.2. Một số tham số thống kê
Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học (Nguyễn Văn Thiện, 2000 [36]).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Số trung bình: xi X = n xi : Tổng các giá trị của x n : Dung lượng mẫu X : Số trung bình - Độ lệch tiêu chuẩn: + Với n > 30: 2 2 i i x Σx Σx S n n + Với n 30: 2 2 i i x Σx Σx S n - 1 n
Trong đó: SX : Độ lệch tiêu chuẩn Xi : Giá trị của mẫu