I.6.2.1. Phương pháp hóa lý
Dùng chất hấp phụ như bentonite (MC 20), silicagel, đất tẩy trắng (fulmont F180)…để hấp phụ chlorophyll và các hợp chất khác hòa lẫn vào dầu.
I.6.2.2. Phương pháp hóa học
Dùng các loại acid vô cơ để kết tủa các hợp chất chlorophyll trong dầu. Các acid vô cơ phổ biến là acid sulphuric, acid phosphoric, acid nitric và acid hydrochloric.
Dùng acid phosphoric: xử lý với acid phosphoric dưới điều kiện chân không thì sẽ
kết tủa một lượng lớn chlorophyll. Tại 1400C, 2400 mg/l acid phosphoric kết tủa 98 % chlorophyll trong dầu canola sau 15 phút khuấy từ. Mức chlorophyll giảm từ 23.8 mg/l xuống ít hơn 0.5 mg/l. Mức chlorophyll còn giảm xuống lớn hơn 0.05 mg/l nếu tinh chế với kiềm và tẩy trắng[20].
Dùng acid sulphuric: mức chlorophyll giảm từ 23.8 mg/l xuống ít hơn 0.5 mg/l
đạt được với 5000 mg/l acid sulphuric ở nhiệt độ phòng[20].
I.6.2.3. Phương pháp sinh học
Dùng chlorophyllase thủy phân chlorophyll và pheophytin thành chlorophyllide và pheophorbide, cộng với isoprenoid alcohol phytol. Chlorophyllide và pheophorbide tan được trong nước và được loại bỏ ra khỏi dầu.
Các loại acid vô cơ như acid phosphoric, acid sulphuric biến đổi chlorophyll thành pheophorbide không tan được trong dầu và được tách ra khỏi dầu.
Phản ứng giữa chlorophyll và acid vô cơ bắt đầu trong điều kiện khan nước, nhóm carbonyl nhận thêm 1 proton, sau đó loại nhóm carboxylic. Phản ứng này cắt mạch bên acid béo phân cực, làm rời khỏi cấu trúc porphyrin của chlorophyll một acid carboxylic, acid carboxylic này không tan trong dầu.
R2 CH H C CH3 CH CH2 O C R1 O H R2 CH H C CH3 CH CH2 O C R1 O H R2 CH C CH3 CH CH2 HO C O R1 R1: Cấu trúc porphyrin của chlorophyll; R2: C15H31
I.6.4. Các phương pháp phân tích chlorophyll I.6.4.1. Phương pháp chuẩn độ
Chlorophyll có thể được xác định bằng chuẩn độ liên kết magnesium (Mg) với ethylenedinitriletetraacetic acid (EDTA - C10H16N2O8). Phương pháp này không phân biệt được giữa chlorophyll A và chlorophyll B, không thuận tiện và nhanh như phương pháp quang phổ. Phương pháp chuẩn độ chỉ phù hợp với những loại mẫu không có sự
thoái biến pheophytin hiện diện.
Nhiều phương pháp quang phổ khác nhau đã phát triển được chia làm 2 nhóm chính:
Nhóm thứ nhất bao gồm những phương pháp cho phép xác định chlorophyll bằng cách đo độ hấp thu tại bước sóng hấp thu cực đại của hai loại chlorophyll A và B, vì vậy không áp dụng trong hệ thống có pheophytin hiện diện.
Nhóm thứ hai có liên quan chính đến việc xác định mức độ chuyển đổi của chlorophyll thành pheophytin. Nhóm này định lượng được bốn thành phần chlorophyll A, chlorophyll B, pheophytin A, pheophytin B trong mẫu dầu.
Phương pháp của H. Niewiadomski, I. Bratkowska và E. Mossakowska dùng để định lượng bốn thành phần chlorophyll A, chlorophyll B, pheophytin A, pheophytin B. Bước sóng phân tích của chlorophyll A, chlorophyll B, pheophytin A, pheophytin B là:
- Chlorophyll A hấp thu ở bước sóng 664 nm. - Chlorophyll B hấp thu ở bước sóng 646 nm. - Pheophytin A hấp thu ở bước sóng 668 nm. - Pheophytin B hấp thu ở bước sóng 656 nm.
Bảng I.11. Hệ số hấp thu riêng trung bình ε (ml × mg-1 × cm-1) của chlorophyll A, chlorophyll B, pheophytin A, pheophytin B trong dung môi n-hexan tại các bước sóng phân tích. Bước sóng 646 nm 656 nm 664 nm 668 nm Chlorophyll A 0.019 0.052 0.083 0.073 Chlorophyll B 0.052 0.039 0.028 0.022 Pheophytin A 0.010 0.025 0.052 0.060 Hệ số hấp thu riêng trung bình ε (ml × mg-1 × cm-1) Pheophytin B 0.021 0.036 0.030 0.026
Nồng độ chlorophyll và các dẫn xuất của chlorophyll được xác định theo hệ
phương trình của H.Niewiadomski, I. Bratkoska và E. Mossakowska (1965), sử dụng hệ số hấp thu được trình bày ở bảng I.11.
A646 = 0.019 × x1 + 0.052 × x2 + 0.010 × x3 + 0.021 × x4 A656 = 0.052 × x1 + 0.039 × x2 + 0.025 × x3 + 0.036 × x4 A664 = 0.083 × x1 + 0.028 × x2 + 0.052 × x3 + 0.030 × x4 A668 = 0.073 × x1 + 0.022 × x2 + 0.060 × x3 + 0.026 × x4 Giải hệ phương trình trên được nghiệm x1, x2, x3, x4:
x1 = 0.38 × A646 – 23.76 × A656 + 72.50 × A664 - 52.34 × A668 x2 = 34.75 × A646 – 28.83 × A656 + 18.20 × A664 – 9.33 × A668 x3 = 3.96 × A646 – 0.12 × A656 - 59.46 × A664 + 67.00 × A668 x4 = - 40.52 × A646 + 92.71 × A656 – 81.78 × A664 + 38.10 × A668
Với x1, x2, x3, x4 lần lượt là nồng độ của chlorophyll A, chlorophyll B, pheophytin A, pheophytin B (đơn vị là ppm).
Ngoài các phương pháp nêu trên, còn có phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dùng để định lượng chlorophyll. Phương pháp này được đề nghị khi trong dầu có những thành phần dẫn xuất chlorophyll khác như chlorophyllide, pheophorbide và pyropheophytin.
II.1. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu ly trích dầu từ tảo Chlorella vulgarisđịnh hướng làm nguyên liệu cho sản xuất biodiesel:
- Nghiên cứu quy trình ly trích dầu từ tảo Chlorella vulgaris được nuôi trồng trong điều kiện môi trường và khí hậu Việt Nam. Tiến hành khảo sát các phương pháp ly trích khác nhau: soxhlet, ngâm dầm cổđiển, ngâm dầm có hỗ trợ siêu âm và các yếu tốảnh hưởng lên hiệu quả ly trích dầu như loại dung môi, thời gian ly trích, độ ẩm, tốc
độ khuấy…
- Nghiên cứu quá trình tinh chế dầu, khảo sát các phương pháp loại bỏ
chlorophyll và các dẫn xuất của chlorophyll bằng các phương pháp khác nhau như: sắc ký cột silicagel, hấp phụđất sét bentonite, hỗn hợp acid phosphoric/acid sulfuric…Từ đó đánh giá và lựa chọn các phương pháp có khả năng ứng dụng tốt trong thực tế.
- Nghiên cứu một số đặc tính hóa lý cơ bản của dầu tảo như chỉ số acid, chỉ số
savon hóa, chỉ số iod, độ nhớt, tỷ trọng, thành phần acid béo trong dầu tảo bằng phương pháp GC-MS. Dựa vào các chỉ số hóa lý này đánh giá khả năng ứng dụng của dầu tảo trong việc làm nguyên liệu cho sản xuất biodiesel.
- Tổng hợp dầu biodiesel dựa trên cơ sở xúc tác kiềm, xác định thành phần metyl ester thu được, đánh giá độ chuyển hóa và hiệu suất của phản ứng.
II.2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
II.2.1. Nguyên liệu
Nguồn tảo giống Chlorella vulgaris được cung cấp bởi bộ môn Công Nghệ Hóa
Học trường Đại học Nông Lâm TP.HCM tuyển chọn qua nhiều nguồn của Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam, khoa Thủy sản trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ.
II.2.2. Thiết bị và dụng cụ
- Máy ly tâm EBA 20. - Hệ thống nuôi tảo.
- Hệ thống thiết bị trích ly Soxhlet 500 ml. - Thiết bị cô quay chân không.
- Máy đo UV- VIS Genesys 20. - Máy cất nước Aquatron. - Máy bơm chân không. - Tủ sấy Memmert.
- Tủ sấy chân không Jisico. - Kính hiển vi.
- Máy sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS Agilent HP 6890N MSD. - Cân điện tử 2 và 4 số lẻ: Sartorius TE 612 và Sartorius TE 214S. - Máy khuấy từ MR Hei – Standard.
- Bồn siêu âm SONIC CLEAN 160 HT. - Giấy lọc polyamide 4.5 μm.
- Máy bơm.
- Các loại dụng cụ thủy tinh.
II.2.3. Hóa chất thí nghiệm
- n-Hexan (Trung Quốc). - Dicloroetan (Trung Quốc). - Chloroform (Trung Quốc). - Metanol (Trung Quốc). - Eter dầu hỏa 60o – 90o (Trung Quốc). - Etanol 96% và 99.5% (Trung Quốc). - Muối ăn (NaCl, Trung Quốc).
- Silicagel (230 – 400 mesh, Merck). - Nước cất.
- Acid sulphuric (H2SO4) 98 % (Trung Quốc). - Acid phosphoric (H3PO4) 85 % (Trung Quốc). - Acid acetic (CH3COOH – Trung Quốc).
- Đất sét bentonite (Al2O3.4SiO2.H2O – Trung Quốc). - Kali hydroxide (KOH - Trung Quốc).
- Dung dịch phenolphtalein 1 % trong cồn 96 %. - Kali clorur (KCl – Trung Quốc).
II.3. THỰC HIỆN NUÔI CẤY TẢO
Dụng cụ thuỷ tinh và môi trường trước khi nuôi phải được hấp khử trùng ở
121oC, 2 atm trong 15 phút. Các bình nhựa nuôi tảo được khử trùng bằng nước muối 20 %, đường ống dẫn khí được xông cồn 99.5% trong thời gian 5 phút.
Cho các chất dinh dưỡng vào môi trường thích hợp để cho tảo phát triển.
Các thao tác vận chuyển và phân phối tảo giống được thực hiện trong khu vực có
độ vô trùng cao. Tảo được nuôi trong các bình 0.5, 5, 140, 300 lít.
Tảo được chiếu sáng 24/24 giờ, với cường độ ánh sáng 3000 – 4000 lux và sục không khí liên tục trong suốt quá trình nuôi.
Tảo được thu hoạch sau khoảng 2 tuần nuôi, lúc sinh khối tảo không tăng lên nữa (theo dõi bằng cách đếm hồng cầu bằng kính hiển vi và đo độđục).
Tảo tươi được ly tâm tách nước, rửa muối thu sinh khối. Sau đó được đem đi sấy
ở 40oC trong 2 ngày, tiếp tục nghiền mịn trở thành tảo khô đồng nhất rồi được đem đi tiến hành ly trích.
II.4. LY TRÍCH DẦU
II.4.1. Ly trích bằng phương pháp chiết soxhlet
Dung môi
Sơđồ II.1. Quy trình ly trích dầu bằng phương pháp chiết soxhlet. Tảo khô Soxhlet Ly tâm, lọc Cô quay Cân Hiệu suất (%)
Cân một khối lượng chính xác 0.8 g tảo bằng cân điện tử 4 số, mẫu trước và sau khi cân đều giử ở bình hút ẩm, sau đó đem ly trích bằng phương pháp chiết soxhlet. Thể tích dung môi được sử dụng cố định mỗi lần là 200 ml, lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy giá trị trung bình. Khi cần khảo sát ảnh hưởng của 1 yếu tố nào lên hiệu suất ly trích dầu thì thay đổi chính yếu tố đó và cố định các yếu tố còn lại. Sau khi ly trích, dung dịch chiết được đưa đi cô quay thu hồi dung môi, sấy phần sau cô quay đến khối lượng không đổi ở 50oC được m1 là cao dạng sệt có chứa dầu (dầu thô).
Hiệu suất ly trích dầu bằng phương pháp soxhlet được tính theo công thức:
1
m
H (%) = 100
0.8× (II.1).
II.4.2. Ly trích bằng phương pháp ngâm dầm[22]
+ Etanol 96 %
Thêm nước Thêm n-hexan
Sơđồ II.2. Quy trình ly trích dầu bằng phương pháp ngâm dầm. Tảo khô Ngâm dầm Ly tâm, lọc Lắng, lóng, tách lấy pha n-hexan Cô quay Cân Hiệu suất (%)
Ngâm mỗi lần 0.8 g tảo trong 5 ml etanol 96 %, khuấy từ trong 24 giờ ở tốc độ
200 rpm. Sau đó đem ly tâm, lọc thu lấy dung dịch etanol, cho thêm nước để đạt nồng
độ nước/etanol là 40 %. Tiếp đó cho thêm 5 ml n-hexan vào, lắc, để yên. Tách pha n-hexan bằng bình lóng, cô quay loại dung môi. Sấy đến khối lượng không đổi, thu
được dầu thô, cân lượng dầu này (có khối lượng là m2). Lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần, lấy giá trị trung bình.
Hiệu suất quá trình ly trích dầu bằng ngâm dầm được tính theo công thức:
2
m
H (%) = 100
0.8× (II.2).
II.4.3. Ly trích bằng phương pháp ngâm dầm với sự hỗ trợ của siêu âm
Các thí nghiệm được tiến hành như mục II.4.2, trong đó tảo được ngâm dầm trong bồn siêu âm có tần số 35 kHz, công suất 1000 W. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm lên hiệu suất ly trích dầu. Đánh giá hiệu quả của phương pháp này.
II.5. KHẢO SÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ DẦU
II.5.1. Tinh chế dầu thô bằng phương pháp sắc ký cột silicagel
Dầu được cân khoảng một lượng là 0.5 g, nhồi vào cột sắc ký đã có sẵn silicagel, kích thước hạt 230 - 400 mesh, kích thước cột 15 × 30 cm, lượng silicagel mỗi lần nhồi là 8.0 g, dung môi giải ly là n-hexan. Trước khi giải ly, dầu được đem pha loãng 100 lần bằng dung môi n-hexan và được đem đo UV ở bước sóng 664 nm. Dầu sau khi qua cột cũng được cô quay loại bỏ dung môi, sau đó pha loãng lại 100 lần rồi đem đo UV. Xác định hiệu suất quá trình tinh chế loại chlorophyll và quá trình thu hồi dầu.
II.5.2. Tinh chế dầu bằng phương pháp hấp phụđất sét
Cũng được tiến hành như theo phương pháp sắc ký cột silicagel, chỉ thay thế
II.5.3. Tinh chế dầu bằng hỗn hợp acid H3PO4/H2SO4[20]
+ 10 % H3PO4/H2SO4 (đđ) (2:1)
Trung hòa bằng KOH 1N dư
Tách pha, rửa nước nóng, lọc
Sơđồ II.3. Quy trình tinh chế dầu bằng acid.
Dầu tảo thô và hỗn hợp 10 % theo khối lượng dầu acid H3PO4 (85 %)/H2SO4 (98 %) (2:1, thể tích) được trộn bằng máy khuấy từ ở tốc độ 250 rpm, tại 500C trong khoảng thời gian 25 phút. Sau đó hỗn hợp được ly tâm 5000 rpm trong 10 phút. Dầu đã ly tâm được trung hòa với dung dịch KOH 1N dư và được rửa với nước nóng để lắng cho xà phòng tách lớp và lọc qua giấy lọc. Sau đó dầu được sấy trong tủ sấy chân không ở áp suất P = 50 mmHg, 50oC, 3 giờ. Dầu trước khi xử lí acid và sau khi sấy
Dầu tảo Khuấy 250 rpm, 50oC, 25’ Ly tâm 5000 rpm 10’ Khuấy 750 rpm, 50oC, 2’ Sấy chân không, P = 50 mmHg, 50oC, 3h Dầu tinh
được đem pha loãng 100 lần và đo độ hấp UV thu ở bước sóng 664 nm để xác định hiệu suất tinh chế. Cân khối lượng dầu tinh thu được để xác định hiệu suất thu hồi dầu.
II.6. KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT HÓA LÝ CỦA DẦU TẢO
- Chỉ số acid, chỉ số savon, chỉ số iod, tỷ trọng, độ nhớt: được xác định theo tiêu chuẩn Việt Nam của Tổng cục đo lường chất lượng Việt Nam và tiêu chuẩn ASTM của Hiệp hội thử nghiệm và vật liệu Hoa Kỳ (trình bày chi tiết trong phụ lục I: Phương pháp xác định chỉ số hóa lý).
- Thành phần acid béo trong dầu tảo được xác định bằng phổ GC-MS tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm – Sở Khoa học Công nghệ TP.HCM.
Điều kiện sắc ký:
- Máy sắc kýkhí ghép khối phổ GC – MS Agilent HP 6890N. - Detector: khối phổ tứ cực MSD.
- Cột mao quản Agilent DB-23; kích thước 30 m × 250 μm × 0.25 μm. - Khí mang Helium.
- Tốc độ dòng 1 ml/phút, áp suất 6.9 psi. - Thể tích bơm mẫu (injector): 1 μl. - Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 250oC. - Nhiệt độ detector: 270oC.
- Chương trình nhiệt: nhiệt độ đầu cột 60oC, tăng đến 130oC với tốc độ
10oC/phút, giữ trong 1 phút, tăng tiếp đến 200oC với tốc độ 5oC/phút, giữ trong 5 phút. - Chất nội chuẩn: nonadecanoic acid (C19:0).
II.7. TỔNG HỢP DẦU BIODIESEL Khuấy từ 200 rpm 60oC, 4h 1). Lắng, tách pha 2). Ly trích 1. Trung hòa CH3COOH 2. Rửa muối KCl 3. Rửa H2O cất 4. Làm khan Na2SO4 5. Lọc
Sơđồ II.4. Quy trình phản ứng tổng hợp biodiesel từ dầu tảo.
Cân 2 gam dầu sau khi đã được tinh chế, cho vào đó 3 ml dung dịch metanol đã
được hòa tan 0.02 gam KOH (tỉ lệ xúc tác so với khối lượng dầu là 1 %). Hỗn hợp
được đun khuấy từ ở nhiệt độ 60oC, 200 rpm trong vòng 4 giờ. Sau đó tiến hành cô 0.02 g KOH + MeOH
(tỉ lệ mol dầu:MeOH = 1:10) Dầu tảo
(2 g)
Transester hóa
Cô quay thu hồi MeOH
Lớp dưới
(glycerin) Lớp trên
Biodiesel tinh khiết
quay loại metanol dư, để lắng trong bình lóng. Phần glycerin nặng hơn ở dưới, phần metyl ester nhẹ hơn ở trên. Tách lấy phần metyl ester này, tiến hành trung hòa kiềm dư
bằng dung dịch acid acetic CH3COOH 1N. Tiếp đó rửa muối bằng KCl 1N, rửa nước, làm khan bằng Na2SO4, lọc thu được sản phẩm biodiesel tinh khiết. Mẫu biodiesel này sau đó tiếp tục được phân tích bằng phổ GC-MS để xác định thành phần và hàm lượng metyl ester thu được.
III.1. LY TRÍCH DẦU
III.1.1. Phương pháp chiết soxhlet
III.1.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi
Tảo sau khi sấy đến khối lượng không đổi được đem đi chiết soxhlet, khối lượng tảo mỗi lần chiết là 0.8 g, thời gian chiết mỗi lần là 4 giờ. Dung môi được thay đổi