III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2.Nội dung 2
đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá của các mẫu giống lúa bằng lây nhiễm nhân tạo
Phương pháp nghiên cứu nội dung 2
3.3.2.1. Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược thực hiện tại khu nhà lưới Bộ môn CNSH, VCL-CTP. Phân bón và các chế ựộ chăm sóc khác ựược thực hiện như thắ nghiệm ngoài ựồng
3.3.2.2. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo
- Vi khuẩn ựược nuôi cấy trên môi trường Wakimoto + Thành phần Khoai tây: 300,0(g) Ca(NO3)2.4H2O: 0.5 (g) Na2HPO4.4H2O: 2,0 (g) Pepton : 5,0 (g) Saccarose : 15,0 (g) Agar : 17,0 (g) PH = 6.8 - 7,0
+ Cách nấu môi trường: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch bằng nước cất, thái mỏng, ựổ 50 ml nước cất vào ựun sôi trong 30 phút. Sau ựó lọc lấy dịch chiết khoai tây, thêm nước cất cho ựủ 1000 ml.
Cân các hoá chất còn lại, lần lượt ựổ vào dịch chiết khoai tây, vừa ựổ vừa khuấy ựều cho tan hết hoá chất. Sau khi ựun cách thuỷ xong, ựổ môi trường vào ống nghiệm và ựem hấp cách thuỷ ở 121,60C trong 15 phút. Trong khi hấp chú ý ựặt nghiêng ống nghiệm ựể tạo mặt môi trường nghiêng. Sau 4 - 8h môi trường ựông lại, tiến hành nuôi cấy vi khuẩn ngay hoặc có thể bảo quản.
- Phương pháp lây nhiễm:
Lây nhiễm khi lúa ựang ở giai ựoạn làm ựòng, bằng cách cắt ựầu lá: dùng kéo ựã khử trùng nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh, cắt lên ựầu lá lúa khoảng 2 Ờ 5 cm, sau 20 ngày ựo chiều dài vết bệnh và ựánh giá.
- Phương pháp ựánh giá khả năng kháng, nhiễm bệnh bạc lá lúa
Sau lây nhiễm 20 ngày, tiến hành ựánh giá khả năng kháng, nhiễm bằng phương pháp ựo chiều dài vết bệnh do GS. Satoru Taura ựề xuất:
+ Chiều dài vết bệnh: < 8cm - Kháng + Chiều dài vết bệnh: 8 - 12cm - Nhiễm vừa + Chiều dài vết bệnh: > 12cm - Nhiễm nặng 3.3.3. Nội dung 3.
Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện khả năng chứa gen kháng Xa4, xa5 và Xa7 của các mẫu giống lúa nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu nội dung 3
3.3.3.1. Bố trắ thắ nghiệm
Thắ nghiệm ựược tiến hành tại phòng sinh học phân tử, Bộ môn CNSH, Viện CLT-CTP
3.3.3.2. Phương pháp tiến hành
* Triết tách DNA: Thực hiện theo phương pháp của Zheng và cộng sự (1995) có cải tiến gồm 4 bước: phá vỡ tế bào, loại bỏ protein, kết tủa DNA, xác ựịnh mức ựộ tinh sạch và nồng ựộ DNA tổng số
- Thành phần dung dịch chiết tách DNA Thành phần Nồng ựộ dung dịch mẹ Nồng ựộ dung dịch làm việc Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tách Tris-HCl (pH=8) 1M 50mM 0,5ml EDTA (pH=8) 0,5M 0,25mM 0,5ml NaCl 5M 300mM 0,6ml SDS 10% 1% 1,0ml H2O 7,4ml + Chuẩn bị Tris HCl 1M, PH = 8
Cân 30,28 g Trizmabase MW: 212.1g (dung dịch rất kiềm) cho vào lọ. đổ vào 200 ml nước cất. Chuẩn ựộ bằng HCl cho tới Ph = 8
đổ thêm nước vào cho tới khi hỗn hợp ựạt 250ml, hấp khử trùng ở 121oc, 15 phút
+ Chuẩn bị ADTA 0.5M, Ph = 8
Cân 46,53g Disodium ethylendimin tetraacetat (dung dịch hơi axit), cho vào lọ
đổ vào 200ml H2O, cho tiếp vào 4g NaOH
Khuấy từ nhẹ nhàng, chỉnh PH bằng NAOH ựậm ựặc và ựổ nước cho tới khi thể tắch ựạt 250ml
+ Chuẩn bị NaCl 5m (MW. 54.44g) Cân 73,05gNaCl cho vào lọ
đổ vào 250ml H2O, khuấy ựều rồi ựem khử trùng + SDS 10% (MW.288.4g)
Cân 25g SDS cho vào lọ
Cho vào 200ml H2O, khuấy ựều từ từ bằng cách tăng thêm nhiệt (do khó tan). Cho thêm 50ml nước, ựể ở nhiệt ựộ phòng
- Thành phần dung dịch ựệm TE dùng ựể hòa tan DNA sau triết tách Thành phần Nồng ựộ dung dịch mẹ Nồng ựộ dung dịch làm việc Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tách Tris-HCl (pH=8) 1M 50mM 0,5ml EDTA (pH= 8) 0,5M 1mM 0,1ml H2O 49,4mll - Quy trình chiết tách: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Bước 1: Chọn mẫu lá cây khoẻ, cắt bỏ vào ống nghiệm có dung tắch 1,5 ml, ựánh dấu tên giống rồi bỏ vào ựá lạnh (lưu ý lên lấy vào buổi sáng sớm)
+ Bước 2: Trong phòng thắ nghiệm các cối, trầy sứ ựã ựược khử trùng ựặt trong ựá lạnh, các mẫu lá ựược cắt nhỏ bỏ vào cối sứ
+ Bước 3: Nhỏ 400ộl dung dịch chiết suất DNA vào cối sứ rồi nghiền nhỏ mẫu lá trong dịch chiết cho ựến khi dung dịch chuyển sang màu xanh ựen chứng tỏ tế bào lá ựã vỡ và diệp lục ựược giải phóng ra
+ Bước 4: Nhỏ thêm 400ộl dung dịch chiết vào, trộn lẫn rồi chuyển 400ộl dung dịch này vào ống nghiệm ựã ựánh dấu cùng giống
+ Bước 5: Nhỏ vào ống nghiệm này 400ộl Phenol: Chloroform: Isolamylalchohol (25:24:1). Sau ựó li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C, lúc này các tạp chất ựược lắng ựọng ở phần ựáy của ống nghiệm. Nhẹ nhàng hút phần dung dịch phắa trên ống nghiệm sang ống nghiệm ựã ựược ựánh dấu cùng giống
+ Bước 6: đổ thêm 400 ộl Chloroform: Isolamyalchohol (24:1). Sau ựó li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C rồi cũng nhẹ nhàng hút phần dịch phắa trên sang ống nghiệm ựã ựược ựánh dấu cùng giống
+ Bước 7: Cho 800 ộl Ethanol 96%, trộn ựều sau ựó li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. Lúc này DNA ựược kết tủa ở phắa ựáy ống nghiệm, ựổ bỏ phần dung dịch và giữ lại kết tủa
+ Bước 8: Rửa sạch kết tủa bằng Ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng
+ Bước 9: Hoà tan kết tủa bằng 50ộl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt ựộ -200C
Lấy 1 ộl dung dịch DNA dùng cho mỗi phản ứng *Kiểm tra ựộ tinh sạch của DNA nguyên bản
Sau khi tách chiết DNA chúng tôi tiến hành kiểm tra ựộ tinh sạch của DNA bằng máy nanodrop
* Phản ứng nhân DNA
- Mồi sử dụng ựể phát hiện các gen kháng bệnh bạc lá lúa Xa4, xa5 và Xa7 Tên mồi Trình tự mồi NST Gen liên kết Khoảg cách (c.M) Nguồn Npb181F
5Ỗ- ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG- 3Ỗ
Npb78R
5Ỗ- GTG CTA TAA AAG GCA TTC GGG -3Ỗ 11 Xa4 1,7 Yoshida et al.1992 RG207F 5Ỗ-ATT GTT ACG TTT GGT GGGGG- 3Ỗ RG207R 5Ỗ-GCC ATG GCG ATC GTC AGTCG- 3Ỗ 5 xa5 0 - 1 Mc Couch et al. 1991 P3 F 5Ỗ- CAG CAA TTC ACT GGA
GTA GTG GTT- 3Ỗ
P3 R 5Ỗ- CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA- 3Ỗ
6 Xa7 2,5 Taura et al. 2003
- Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) ựược thực hiện theo nguyên lý của Karry Mullis và cộng sự (1980).
+ Các thành phần tham gia phản ứng: STT Thành phần Nồng ựộ dung dịch Thể tắch ộl 1 Nước cất vô trùng 13,3 2 PCR buffer 10X 2,0 3 dNTPs 2,5mM 1,6 4 Primer-F 10pmol/ộl 1,0 5 Primer-R 10pmol/ộl 1,0
6 DNA Tag polymerase 5 unit/ộl 0,1
+ Cho 19ộl cocktai ựã pha chế vào mỗi ống.
+ Cho tiếp 1ộl DNA ựã chiết tách vào mỗi ống, ựậy nắp cẩn thận và Voltex nhẹ
+Phản ứng PCR ựược tiến hành theo chu trình nhiệt gồm 4 bước sau: Bước Nhiệt ựộ (oC) Thời gian (phút) Số chu kỳ
I 94 4 1 94 0,5 35-56 0,5 II 72 1 34 III 72 5 1 IV 4
* Chu trình nhân gen Xa4, Xa7
Bước Nhiệt ựộ (0C) Thời gian (phút)
1 94 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2 94 1
3 56 1
4 72 2
5 Lặp lại 34 chu kỳ từ bước 2
6 72 8
7 4
Chu trình nhân gen xa5:
Bước Nhiệt ựộ (0C) Thời gian (phút)
1 94 4
2 94 1
3 60 1
4 72 1 phút và 50 giây
5 Lặp lại 34 chu kỳ từ bước 2
6 72 7
7 4
8 END
* điện di sản phẩm PCR
- để phát hiện gen xa5 chúng tôi sử dụng phương pháp ựiện di sản phẩm trên gen agarose 2%
+ Dung dịch ựiện di: 50X TAE (2M Tris- acete pH= 8.0; 0.05m EDTA)
Tris 60.5g
Acetic acid 14.3 ml
ADTA 0.5ml
H2O 150ml
Pha loãng 50X TAE thành dung dịch 1X TAE bằng cách pha 20ml 50X TAE vào trong 980ml nước cất 2 lần.
+ Chuẩn bị gel agarosse 2% (1,5g agarose + 100ml 1X TAE)
đun agarose trong lò vi sóng ựến khi dung dịch trở nên trong suốt, lấy ra dùng máy khuấy từ làm tan hoàn toàn, ựể nguội. Sau ựó ựặt lược tạo giếng (dán băng dắnh vào khuôn ựể tránh rò rỉ gel) rồi ựổ dung dịch agarose 2% vào khuôn và ựể nguội (Lưu ý không ựể lại bọt khắ ở ựáy lỗ khuôn, khi gel ựông kết mới bỏ lược ra).
Sau khoảng 30 phút ựể gel ựông lại, bỏ băng dắnh ở ựầu cuối khuôn, tháo lược và ựặt khay khuôn gel vào bể ựiện di, ựổ dung dịch ựiện di ngập gel khoảng 4mm. Trải một mảng parafin, nhỏ 2ộl loading bufet, trộn với 8ộl dung dịch PCR, nhỏ hỗn hợp vào giếng. Sau ựó cắm nguồn ựiện một chiều (75V) chạy trong khoảng 25 ựến 30 phút. DNA mang ựiện tắch âm sẽ chạy về ựiện cực dương của nguồn ựiện. Sau khi chạy ựiện di xong, nhuộm bản ựiện di bằng Ethilium Bromide nồng ựộ 10mg/ml trong 10phút và quan sát vệt band trên máy chiếu tia UV
để phát hiện gen Xa4 và Xa7 chúng tôi sử dụng phương pháp ựiện di mao quản: Dùng pipet hút 13ộl sản phẩm PCR vào kênh giếng ựiện di rồi ựặt vào máy ựiện di mao quản ựược kết nối với màn hình vi tắnh. Sau 10 phút các vệt band xuất hiện. Giống nào xuất hiện vệt band trùng với ựối chứng dương là giống có chứa gen kháng, giống nào xuất hiện vệt band trùng với ựối chứng âm là giống không chứa gen kháng.
3.4.Phương pháp xử lý số liệu
IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1. Kết quả theo dõi ựặc ựiểm nông sinh học của các giống lúa tham gia thắ nghiệm vụ xuân 2011 thắ nghiệm vụ xuân 2011
4.1.1. Tình hình sinh trưởng phát triển ở giai ựoạn mạ
Trong chu trình sống, tất cả các loài sinh vật ựều trải qua ba giai ựoạn cơ bản là giai ựoạn non trẻ, giai ựoạn trưởng thành và giai ựoạn già cỗi.
Ở cây lúa, thời kỳ mạ là giai ựoạn ựầu tiên của quá trình sinh truởng phát triển. Thời kỳ này ựược tắnh từ khi gieo hạt ựến khi cấy, thời gian này dài hay ngắn tuỳ thuộc chủ yếu vào giống, phương thức làm mạ, ựiều kiện ngoại cảnh và thời vụ. Nhìn chung, thời gian sinh trưởng của cây lúa ở thời kỳ mạ không dài nhưng lại có ý nghĩa quyết ựịnh ựến sinh trưởng và năng suất lúa sau này. Cây mạ sinh trưởng tốt sẽ tạo ựiều kiện tốt cho cây lúa sau cấy chóng bén rễ hồi xanh, sớm ựẻ nhánh, tạo ựà cho cây lúa sinh trưởng tốt ở những giai ựoạn tiếp theo.
Tiêu chuẩn một ruộng mạ tốt ựó là mạ cứng cây, tỷ lệ ngạnh trê cao, bộ rễ khoẻ, lá xanh ựậm, tuổi mạ không quá già và không bị sâu bệnh.
Vì vậy, khi làm thắ nghiệm chúng tôi ựã tiến hành ựánh giá tình hình sinh trưởng, phát triển của cây mạ theo các chỉ tiêu: Chiều cao cây mạ, số lá mạ, màu sắc lá mạ và sức sinh trưởng của cây mạ theo thang ựiểm của IRRI:
điểm 1: Sức sống rất mạnh điểm 3: Sức sống mạnh điểm 5: Sức sống trung bình điểm 7: Sức sống yếu
điểm 9: Sức sống rất yếu
Bảng 4.1. Tình hình sinh trưởng ở giai ựoạn mạ của các giống lúa STT KH Giống Tuổi mạ (ngày) Chiều cao cây mạ (cm) số lá mạ Màu sắc lá mạ Sức sống (ựiểm) 1 10006 54 20.6 4.3 Xanh ựậm 5 2 10010 54 21.2 4.1 Xanh ựậm 3 3 10013 54 19.9 4.3 Xanh ựậm 3 4 10019 54 22.8 4.2 Xanh nhạt 1 5 10025 54 20.1 4.2 Xanh ựậm 3 6 10028 54 19.9 4.3 Xanh ựậm 3 7 10032 54 22.1 4.1 Xanh nhạt 1 8 10036 54 21.9 4.2 Xanh ựậm 3 9 10037 54 18.3 4.2 Xanh nhạt 5 10 10040 54 24.4 4.6 Xanh ựậm 3 11 10051 54 22.8 4.4 Xanh ựậm 5 12 10054 54 21.7 4.5 Xanh ựậm 3 13 10057 54 23.9 4.5 Xanh ựậm 3 14 10064 54 21.0 4.3 Xanh ựậm 3 15 10066 54 18.7 4.4 Xanh nhạt 7 16 10068 54 24.5 4.5 Xanh ựậm 3 17 10075 54 22.9 4.4 Xanh nhạt 3 18 10079 54 21.4 4.2 Xanh ựậm 3 19 10084 54 20.8 4.2 Xanh nhạt 1 20 10087 54 22.0 4.4 Xanh nhạt 3 21 10091 54 24.5 4.4 Xanh ựậm 3 22 10096 54 23.9 4.3 Xanh ựậm 5 23 10103 54 24.2 4.6 Xanh ựậm 3 24 10108 54 22.9 4.3 Xanh ựậm 3 25 10115 54 24.8 4.5 Xanh ựậm 3 26 10119 54 23.9 4.4 Xanh ựậm 3 27 10123 54 21.3 4.2 Xanh ựậm 1 28 10128 54 23.5 4.4 Xanh ựậm 3 29 10132 54 21.5 4.4 Xanh ựậm 3 30 10135 54 24.6 4.2 Xanh ựậm 3 31 10137 54 24.5 4.3 Xanh ựậm 3 32 10138 54 24.5 4.4 Xanh ựậm 3 33 10143 54 24.3 4.4 Xanh ựậm 3 34 10149 54 18.3 4.2 Xanh nhạt 1 35 10155 54 20.9 4.2 Xanh ựậm 3 36 10162 54 22.4 4.1 Xanh nhạt 3 37 10169 54 24.2 4.3 Xanh ựậm 5 38 10178 54 21.1 4.4 Xanh ựậm 3 39 10189 54 23.3 4.3 Xanh ựậm 3 40 KD 54 24.3 4.4 Xanh ựậm 3
- Nhìn chung vụ xuân 2011 ựiều kiện thời tiết không thuận lợi cho cây lúa sinh trưởng, phát triển ở giai ựoạn mạ (liên tục xuất hiện các ựợt rét ựậm, rét hại kéo dài) gây ảnh hưởng xấu tới ựời sống cây mạ nói chung, nhưng các giống lúa tham gia thắ nghiệm ựều ựược che phủ linon chống rét ngay sau gieo nên ở giai ựoạn mạ cây lúa vẫn sinh trưởng, phát triển khá tốt: Biểu hiện như tuổi mạ của các giống lúa tham gia thắ nghiệm là 54 ngày, chiều cao cây mạ ựạt từ 18,3 cm (10149) ựến 24,8 cm (10115), số lá mạ dao ựộng từ 4,1 (10010, 10032, 10155) ựến 4,6 lá (10040). Còn ựối chứng KD có chiều cao cây mạ ựạt 25,6 cm, số lá mạ ựạt 4,5 lá.
- đa số các giống lúa thắ nghiệm ở vụ xuân 2011 ựều có màu sắc lá mạ từ xanh trung bình ựến xanh ựậm, một số ắt giống có màu sắc lá mạ xanh nhạt. đối chứng KD có màu sắc lá xanh ựậm. Sức sống ở giai ựoạn mạ của các giống lúa tham gia thắ nghiệm ựa số ựạt từ trung bình ựến rất tốt (từ ựiểm 5 trở lên) tương ựương với ựối chứng KD (ựiểm 3). Chỉ duy nhất giống có kắ hiệu 10066 có sức sống hơi yếu (ựạt ựiểm 7). Như vậy, qua theo dõi 4 chỉ tiêu chiều cao cây mạ, số lá mạ, màu sắc lá mạ và sức sống mạ trước khi cấy thì các giống lúa thắ nghiệm ựều ựạt mức sinh trưởng mạnh, ựủ tiêu chuẩn ựưa ra ruộng cấy.
4.1.2. Thời gian qua các giai ựoạn sinh trưởng
Thời gian sinh trưởng của cây lúa ựược tắnh từ khi nảy mầm ựến khi chắn hoàn toàn. Thời gian sinh trưởng dài hay ngắn phụ thuộc vào ựặc tắnh di truyền của giống, thời vụ gieo cấy, ựiều kiện ngoại cảnh, trình ựộ thâm canh của từng ựịa phương. Thường thì các giống lúa ựịa phương có tổng thời gian sinh trưởng dài hơn các giống lúa cải tiến.
Ở Miền Bắc, do thời tiết biến ựộng trong năm, nhất là nhiệt ựộ nên thời gian sinh trưởng của cây lúa ở mỗi mùa vụ gieo cấy cũng khác nhau. Cùng một giống, ở vụ xuân do nhiệt ựộ thấp nên tổng thời gian sinh trưởng của cây lúa dài ngày hơn vụ mùa. Cũng trong vụ xuân ở những năm trời rét thì lúa
sinh trưởng kéo dài, trỗ muộn hơn những năm trời nắng ấm. Còn trong vụ mùa, nhiệt ựộ ắt thay ựổi qua các năm nên thời gian sinh trưởng của các giống lúa tương ựối ổn ựịnh hơn.
Nhìn chung, thời gian sinh trưởng của các giống lúa quá dài hay quá ngắn ựều cho năng suất không cao, vì nếu thời gian sinh trưởng quá dài dễ gây lốp ựổ và không tránh khỏi ảnh hưởng xấu do thiên tai gây ra. Còn thời gian sinh trưởng quá ngắn sẽ làm giảm tỷ lệ chất khô ựược tắch luỹ vào hạt. Trong toàn bộ thời gian sống, cây lúa trải qua nhiều giai ựoạn sinh trưởng, phát triển khác nhau: Thời kỳ mạ, thời kỳ ựẻ nhánh, làm ựốt, làm ựòng, thời kỳ trỗ và chắn. Ở mỗi giai ựoạn ựể có tác ựộng trực tiếp hoặc gián tiếp ựến việc hình thành năng