II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2.9. Các phương pháp chọn tạo giống kháng bệnh
2.2.9.1. Phương pháp lai hữu tắnh
Trung là nước có nền nông nghiệp phát triển, phương pháp lai hữu tắnh ựã ựược các nhà khoa học nông nghiệp Trung Quốc áp dụng rất rộng rãi. Nhờ phương pháp này họ ựã chuyển ựược một có gen có khả năng chống bệnh cao vào một số giống quan trọng trong quy trình sản xuất lúa lai 3 dòng. Vắ dụ
như Xa - 21, là gen có phổ chống rộng ựối với các nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá ựã ựược chuyển thành công vào ''Minghui 63'', là một dòng phục hồi ựược sử dụng rộng rãi trong quy trình sản xuất lúa lai 3 dòng ở Trung Quốc [55].
Cũng nhờ phương pháp này mà các nhà khoa học trên thế giới ựã tạo một loạt giống chống bệnh tốt, năng suất cao: II You 084 (9,24 tạ/ha), Shennong 1033 ...và một số dòng kiểu cây mới cho năng suất cao như: IR65598-112, IR65600-42 và IR65600-96....
Tuy nhiên, cần chú ý trong chu trình sản xuất hạt lai F1 thương phẩm thì không nên sử dụng những gen ựiều khiển tắnh chống bệnh là gen lặn (xa - 5, xa - 13...) mà chỉ nên sử dụng các gen trội kiểm tra tắnh chống bệnh (Xa - 7, Xa - 21...). Như vậy, con lai F1 mới có khả năng chống bệnh ổn ựịnh. Còn những gen lặn chỉ nên sử dụng cho quá trình chọn tạo giống lúa thuần. Khi ựó ựặc tắnh chống bệnh của cây nhanh ổn ựịnh hơn qua các thế hệ.
2.2.9.2. Phương pháp gây ựột biến
Trên thực tế người ta ựã chọn ựược giống chống bệnh bạc lá Fuzhu 2, ựược tạo ra bởi tác dụng gây ựột biến của tia gama. Và tắnh chống bệnh của dòng này vẫn ựược duy trì ở các thế hệ sau. Tuy nhiên việc ứng dụng phương pháp này rất hạn chế do tắnh chất nguy hiểm khi sử dụng các tia phóng xạ ựể gây ựột biến.
2.2.9.3. Ứng dụng công nghệ chỉ thị phân tử
Qua hơn nửa thế kỷ phát triển kể từ ngày Watson và Crick (1953) phát minh ra cấu trúc xoắn kép của DNA, nền công nghệ sinh học thế giới ựã có bước tiến vượt bậc và khẳng ựịnh vai trò to lớn của nó trong nhiều lĩnh vực [18]. Hiện nay, các nhà khoa học thường ứng dụng công nghệ sinh học vào chương trình chọn tạo giống chống bệnh thông qua việc dùng chỉ thị phân tử DNA ựể xác ựịnh trình tự có mặt của các gen kiểm tra tắnh chống bệnh. Nhờ áp dụng chỉ thị phân tử DNA (RFLP) có thể xác ựịnh ựược vị trắ từng gen trên nhiễm sắc thể thông qua ựoạn DNA dò ựặc hiệu liên kết với gen ựó với
khoảng cách gen nhất ựịnh, từ ựó xây dựng bản ựồ di truyền cho các gen kháng. Một số gen ựã ựược xác ựịnh bằng chỉ thị phân tử như: gen Xa - 4 liên kết với RFLP ở locus Npb181 và Npb 78 trên NST số 11 (Yoshidaet al.1992). Với khoảng cách liên kết ựều là 1.7cM. Gen lặn xa - 5 liên kết với chỉ thị RG556 trên nhiễm sắc thể số 5 với khoảng cách là 0-1cM (MC Cough et.1991). Gen Xa - 7 liên kết chặt với chỉ thị P3 trên nhiễm sắc thể số 6 với khoảng cách 2,5 cM. Còn gen xa21 thì liên kết với chỉ thị pTA818 và pTA248 với khoảng cách 0-1cM (Ronald et al.1992) [35]. Tuy nhiên, áp dụng phương pháp RFLP thường mất nhiều thời gian, lượng DNA cần tinh khiết, nhiều khi phải dùng ựến phóng xạ, nên khó áp dụng rộng rãi. để khắc phục nhược ựiểm này người ta ựề xuất chuyển sang phương pháp chọn lọc gián tiếp trên cơ sở nhân DNA bằng phương pháp PCR, sau ựó chạy ựiện di rồi xác ựịnh sự ựa hình giữa kiểu gen kháng và nhiễm.
* Kỹ thuật PCR
Năm 1993, Tiến sỹ hoá học Karry Mullis người Nhật Bản ựã nhận ựược giải thưởng Nobel hoá học nhờ phát minh ra kỹ thuật PCR. đây là một trong những thành tựu nổi bật nhất thập kỷ qua. Phản ứng này ựã mang lại những ứng dụng vô cùng to lớn trong y học, sinh học, khoa học hình sự và khảo cổ học [35].
* Khái niệm:
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) dùng ựể nhân bất kỳ một ựoạn gen nào trong cơ thể sinh vật, chỉ cần sử dụng hai ựoạn Nucleotit mồi ở ựầu 5Ỗ và ựầu 3Ỗ của ựoạn ựó nếu gen ựó ựã biết trước ựược trình tự sắp xếp các Nucleotit của nó. Sau ựó phân tách bằng ựiện di trên gen agarose, nhuộm bằng Ethillium bromide và quan sát kết quả sau khi chiếu bằng tia UV[41].
* Nguyên lý.
PCR là kỹ thuật dựa trên cơ sở tái bản phân tử DNA cần có một số yếu tố như: Enzim Tap DNA polymerase, 4deoxyribonuclotide triphotphat (dNTPs),
MgCl2, hai hoặc một ựoạn nucleotide, môi trường muối ựệm. Tất cả ựược trộn lẫn với một lượng DNA nguyên bản. Sau một số chu kỳ phản ứng nhiệt, có thể nhân ựược một lượng lớn DNA từ DNA nguyên bản ban ựầu.
Tuỳ từng ựoạn mồi khác nhau mà ta thiết lập chu kỳ của phản ứng PCR khác nhau, tuy nhiên chúng ựều dựa trên nguyên lý chung theo sơ ựồ:
Tách 2 sợi ựơn từ sợi
DNA kép (900C, trong 5 phút)
Giai ựoạn tách hai sợi ựơn Tiếp cặp giữa ựoạn mồi với từ sợi DNA kép (940C, cặp bổ xung của sợi DNA ựơn
trong 30giây) (30 Ờ 650C, trong 3 phút)
Tổng hợp sợi DNA ựơn mới (65 -750C, trong 2 Ờ 5 phút)
để nhân bất kỳ một ựoạn DNA nào nếu biết trước ựược trình tự sắp xếp các nucleotit trên mạch ựó thì ựầu tiên là phải thiết kế và tổng hợp hai ựoạn mồi thường dài từ 20 Ờ 30 nucleotit ựối xứng với các base ở ựầu 5Ỗ và ựầu 3Ỗcủa ựoạn DNA ựịnh nhân. Hiện nay, việc thiết kế các ựoạn mồi ựược bán sẵn trên thị trường do việc thiết kế khá ựơn giản [53].
Việc sử dụng kỹ thuật PCR ngày càng rộng rãi do nó có một số ưu ựiểm như:
- Có khả năng chọn lọc ựồng thời nhiều tắnh trạng.
- Có khả năng chọn lọc sớm từ giai ựoạn cây nonựối với những tắnh trạng biểu hiện muộn.
- Mất ắt thời gian ựể phân tắch một mẫu, giá thành vừa phải.
- Chỉ cần một lượng nhỏ DNA (20 -30 nucleotit), không cần tinh khiết lắm, do vậy giảm bớt chi phắ trong tách chiết DNA.
Kỹ thuật phân biệt các ựoạn DNA dựa trên nguyên tắc ựiện di như sau: DNA ựược ựặt trong môi trường agarose, nó sẽ di chuyển về anot của nguồn ựiện một chiều bằng vận tốc tương ứng với trọng lượng phân tử của nó (do DNA là một ựoạn phân tử mang ựiện tắch âm).