3. í NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.4.Tỡnh hỡnh nghiờn cứu đụng lạnh tinh dịch lợn trong nƣớc và ngoài nƣớc.
với thời gian là 20 giõy.
1.4. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu đụng lạnh tinh dịch lợn trong nƣớc và ngoài nƣớc nƣớc
1.4.1. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu ngoài nước
Theo nhà bỏc học nổi tiếng ngƣời Nga I.I. Ivanụp (1900) (Trớch dẫn theo Nguyễn Tấn Anh [12]) “ Tinh thanh chỉ giỳp cho tinh trựng hoạt động, nú khụng cần thiết cho quỏ trỡnh thụ thai và cú thể dựng tinh trựng đó đƣợc pha loóng trong cỏc dung dịch nhõn tạo để dẫn cho sỳc vật cỏi mà vẫn sinh ra đời con một cỏch bỡnh thƣờng ”. Quan điểm nổi tiếng này đó đặt nền múng cho hàng loạt cụng trỡnh nghiờn cứu về mụi trƣờng pha loóng và bảo tồn tinh dịch của vật nuụi sau này.
Cỏc tỏc giả ngƣời Anh là Polge và Rowson là những ngƣời đầu tiờn nghiờn cứu về vấn đề này. Sau đú cỏc tỏc giả khỏc đó phỏt triển nú mạnh mẽ và phổ biến, trong suốt những năm 1950 và 1960, những nghiờn cứu bảo tồn đụng lạnh sõu tinh trựng lợn là cải tiến quy trỡnh đụng lạnh tinh dịch của bũ. Kết quả là tinh trựng cú khả năng hoạt động sau giải đụng nhƣng khụng cú khả năng sinh sản.
Dự một vài bỏo cỏo tuyờn bố thành cụng trong bảo quản đụng lạnh cú khả năng thụ thai của tinh trựng trong một số tài liệu trƣớc năm 1970, nhƣng những kết quả nghiờn cứu đú đó khụng thể lặp lại đƣợc. Năm 1970, nghiờn
cứu đầu tiờn thành cụng trong sử dụng tinh đụng lạnh cho sinh sản bằng phƣơng phỏp đụng lạnh và giải đụng tinh dịch lợn đó đƣợc bỏo cỏo bởi Polge
và cs (1979) [34]. Tuy nhiờn, sự thụ tinh chỉ thành cụng trong vũi trứng, nghĩa là phải phẫu thuật để thụ tinh. Khả năng sinh sản sử dụng tinh đụng lạnh, thụ tinh qua cổ tử cung, đó đƣợc bỏo cỏo bởi 3 nhúm khỏc nhau năm 1971 (Crabo và Einarsson, 1971 [20]; Graham và cs, 1971 [25]; Pursel và Johnson, 1971 [35]). Những cụng bố này đỏnh dấu sự kết thỳc một thời gian dài tỡnh trạng khụng chắc chắn trong đụng lạnh tinh dịch lợn, theo đú cú thể đụng lạnh sõu tinh trựng mà vẫn giữ đƣợc khả năng sinh sản.
Sau những nghiờn cứu ban đầu, nhiều cố gắng bắt đầu nhắm đến phỏt triển và chỉnh sửa cho hoàn chỉnh hơn quy trỡnh đụng lạnh tinh dịch lợn. Tới tận ngày nay, đụng lạnh trong cọng rạ (Westendorf và cộng sự, 1975) [50] và đụng viờn (Pursel và Johnson, 1975) [36], là những phƣơng phỏp thƣờng đƣợc sử dụng nhất. Kết quả dẫn tinh cho lợn bằng tinh đụng lạnh cho thấy, lợn nỏi mang thai và sinh sản thành cụng khi sử dụng tinh đụng lạnh. Tuy nhiờn, kết quả thụ thai và số con sinh ra trong một ổ khụng cao bằng sử dụng tinh dịch lỏng. Bởi vậy, nhiều cố gắng trong thời gian dài nhằm làm sỏng tỏ cỏc vấn đề liờn quan đến đụng lạnh và giải đụng tinh dịch, nhƣ: nguyờn nhõn thực tế, hạ giỏ thành sản phẩm, sự đồng đều trong sức sống của tinh trựng... đó đƣợc tiếp tục nghiờn cứu.
Việc sử dụng tinh đụng lạnh hiện nay chiếm tỷ lệ nhỏ hơn 1% so với thụ tinh nhõn tạo trờn thế giới (Wagner và Thibier 2000) [45]. Tỷ lệ lợn đẻ do sử dụng tinh đụng lạnh đạt 40 - 70% (thấp hơn 20 - 30% so với sử dụng tinh dịch lỏng) và mỗi lứa đẻ là 7 - 10 lợn con đƣợc sinh ra trong một ổ (thấp hơn khoảng 2 - 3 con so với sử dụng tinh dịch lỏng)(Almlid và Hofmo, 1996 [19]). Hiện nay, nghiờn cứu đụng lạnh tinh dịch trờn thế giới đƣợc tiến hành rất phổ biến. Nhật Bản từ năm 1990 đó nghiờn cứu thành cụng kỹ thuật đụng lạnh tinh dịch lợn. Trạm thực nghiệm Ibaragi thuộc Trung tõm giống quốc gia
Nhật Bản đó thành cụng trong việc đụng lạnh tinh dịch cỏc giống lợn địa phƣơng cú hoạt lực tinh trựng sau giải đụng đạt 33% - 40%.
Theo Kim.I.C (Viện nghiờn cứu chăn nuụi Hàn Quốc) (2007) [30], sử dụng tinh dịch lợn đụng lạnh của cỏc giống Landrace, Yorkshire, Duroc, tỷ lệ thụ thai 61,8-74,6% , số con trờn ổ 8,1-8,7.
Nguyờn tắc cơ bản về kỹ thuật đụng lạnh tinh dịch lợn là giảm đến mức tối thiểu quỏ trỡnh trao đổi chất của tế bào tinh trựng nhƣng vẫn giữ đƣợc sự cõn bằng ASTT nội và ngoại bào. Việc phỏt minh ra cơ chế tỏc dụng của Glyxeryl, Ethylenglycol và lũng đỏ trứng gà trƣớc đõy đó thỳc đẩy sự phỏt triển của cụng nghệ này thỡ ngày nay với kỹ thuật tiờn tiến ngƣời ta đó cú thờm những hoỏ chất mới nhƣ Tris, BSA, Hepes là những dung dịch pha sẵn khụng cần đến lũng đỏ trứng gà.
1.4.2. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trong nước
Về đụng lạnh tinh dịch gia sỳc đó thành cụng và ỏp dụng mạnh mẽ trong sản xuất nhƣ tinh đụng lạnh bũ sữa, bũ thịt tại Trung tõm đụng lạnh Moncada thuộc Cụng ty truyền giống gia sỳc trung ƣơng. Đối với gia sỳc khỏc đó cú một số nghiờn cứu đụng lạnh tinh dịch đó đƣợc cụng bố nhƣng chƣa hoàn chỉnh và chƣa cú sản phẩm hàng hoỏ. Đào Đức Thà và cs (1996) [18] thuộc Viện Chăn Nuụi đó tiến hành đụng lạnh tinh dịch dờ Bỏch Thảo dạng viờn. Đỗ văn Thu (2005) [15] thuộc Viện cụng nghệ sinh học cũng đó tiến hành đụng lạnh tinh dịch cừu dạng cọng rạ. Đối với lợn, những nghiờn cứu về đụng lạnh tinh dịch dạng viờn đó đƣợc tiến hành rất sớm tại Viện cụng nghệ sinh học nhƣng cũng chƣa hoàn chỉnh để cú thể trở thành cụng nghệ phục vụ sản xuất.
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Đối tƣợng, vật liệu nghiờn cứu
2.1.1. Tinh dịch lợn đực
Tinh dịch của một số giống lợn hiện đang đƣợc nuụi tại Viện chăn nuụi : Landrace, Yorkshire, Duroc.
2.1.2. Hoỏ chất và cỏc dụng cụ thớ nghiệm.
- Cỏc loại hoỏ chất : glucose, lactose, natri citrate, natri bicacbonate, Trilon B (EDTA), OEP (Orvus-Es-Paste), KCl, penicillin, streptomycin, amykacin, NaCl 0,9%, Cafein, nƣớc cất, nitơ lỏng, ...
- Dụng cụ thớ nghiệm : hệ thống kiểm tra đỏnh giỏ chất lƣợng tinh dịch (Computerized Digital Semen Analysis), bao gồm: mỏy vi tớnh cú cài phần mềm Sperm Vision 3.0, kớnh hiển vi phản pha cú camera tốc độ cao. Tủ bảo ụn, mỏy ly tõm lạnh, mỏy đo ỏp lực thẩm thấu osmometer, mỏy đếm tinh trựng SDM-5, mỏy đo pH (pH meter), bỡnh nitơ, dụng cụ đụng lạnh, micropipet, cọng rạ 5ml dựng cho đụng lạnh tinh dịch lợn của hóng Minitab.
2.2. Yờu cầu
- Tinh dịch lợn đụng lạnh dạng cọng rạ cú hoạt lực (A) ≥40%
- Tinh dịch lợn đụng lạnh dạng cọng rạ đạt tiờu chuẩn trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm, trong sản xuất tỷ lệ thụ thai >50 %.
2.3. Thời gian và địa điểm nghiờn cứu
- Thời gian: đề tài đƣợc tiến hành từ thỏng 1/2008 đến thỏng 12/2008. - Địa điểm: nghiờn cứu đƣợc tiến hành tại Phũng thớ nghiệm bộ mụn Sinh lý sinh hoỏ và tập tớnh vật nuụi, Phũng nghiờn cứu tế bào động vật, Trung tõm thực nghiệm và bảo tồn vật nuụi- Viện chăn nuụi.
2.4. Nội dung và phƣơng phỏp nghiờn cứu
Sơ đồ bố trớ thớ nghiệm: Thớ nghiệm đƣợc bố trớ theo sơ đồ sau
Tinh dịch lợn Cỏc nghiờn cứu về đỏnh giỏ chất
lƣợng tinh dich (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lựa chọn mẫu tinh đạt chất lƣợng Ly tõm Cỏc nghiờn cứu về Mụi trƣờng ly tõm Cỏc nghiờn cứu so sỏnh về phƣơng phỏp ly tõm
Xử lý đụng lạnh Cỏc nghiờn cứu về mụi trƣờng
đụng lạnh
Cõn bằng Cỏc nghiờn cứu về phƣơng phỏp
cõn bằng
Đụng lạnh Cỏc nghiờn cứu về kỹ thuật
đụng lạnh
Giải đụng Cỏc nghiờn cứu về phƣơng phỏp
giải đụng
Sử dụng tinh đụng lạnh
2.4.1. Nghiờn cứu một số chỉ tiờu đỏnh giỏ chất lượng của tinh dịch lợn trước khi đụng lạnh
2.4.1.1. Màu sắc tinh dịch
Màu sắc của tinh dịch đƣợc đỏnh giỏ bằng mắt thƣờng ngay sa u khi thu thập tinh.
2.4.1.2. Lƣợng tinh dịch trong một lần lấy tinh (V, ml)
Sau khi lấy tinh, lọc bỏ ngay chất keo phốn (dựng 4-6 lớp vải màn sạch đó vụ trựng, hoặc dựng giấy lọc). Tinh dịch đó lọc hứng vào lọ cú khắc độ. Khi kiểm tra cần đặt ngang tầm mắt, đọc kết quả ở đỏy mặt cong của tinh dịch. 2.4.1.3. Hoạt động của tinh trựng
Là tỷ lệ (% ) tinh trựng hoạt động (M motility % ) gồm:
+ Tỷ lệ tinh trựng tiến thẳng: hoạt lực A ( progressive motility % ) + Tinh trựng hoạt động tại chỗ: L ( Local motility %)
2.4.1.4. Tinh trựng khụng hoạt động ( I: Immotile %)
Chỉ tiờu hoạt động của tinh trựng và tinh trựng khụng hoạt động đều đƣợc đỏnh giỏ bằng hệ thống Sperm Vision 3.0 (Phƣơng phỏp tiến hành trỡnh bày trong phần phụ lục)
2.4.1.5.Nồng độ tinh trựng (C, triệu/ml)
Nồng độ tinh trựng đƣợc đỏnh giỏ bằng mỏy so màu SDM-5 của hóng Minitub (Đức). ( Phƣơng phỏp tiến hành trỡnh bày trong phần phụ lục)
2.4.1.6. Tổng số tinh trựng tiến thẳng trong tinh dịch VAC ( tỷ/lần lấy tinh) VAC =V (ml)x A x C ( tr/ml)
Dựa vào chỉ tiờu tổng số tinh trựng tiến thẳng để quyết định số liều tinh sản xuất.
2.4.1.7. pH của tinh dịch Sử dụng mỏy đo pH 2.4.1.8. Áp suất thẩm thấu
Đo ASTT của tinh dịch lợn trờn mỏy đo tự động Osmometer Type 5 của hóng Minitub (Đức). ( Phƣơng phỏp tiến hành trỡnh bày trong phần phụ
2.4.1.9. Tỷ lệ tinh trựng kỳ hỡnh
- Phƣơng phỏp: làm tiờu bản cố định và quan sỏt trực tiếp trờn màn hỡnh vi tớnh của phần mềm Sperm Vision. ( Phƣơng phỏp tiến hành trỡnh bày trong phần phụ lục)
2.4.1.10. Phƣơng phỏp nghiờn cứu acrosome của tinh trựng
- Phƣơng phỏp: nhỏ một giọt tinh nguyờn hoặc tinh pha lờn trờn phiến kớnh. Sau đú nhỏ một giọt dung dịch Acro - stain của hóng IMV (Phỏp) bờn cạnh giọt tinh. Dựng đũa thuỷ tinh trộn đều, dàn mỏng tiờu bản trờn phiến kớnh rồi để khụ. Xem trờn kớnh hiển vi phản pha với độ phúng đại 400 lần(10 x 40). Đếm số tinh trựng khụng cũn acrosome nguyờn vẹn trờn tổng số tinh trựng quan sỏt đƣợc trờn một vi trƣờng. Chỳng ta nhận thấy acrosome của tinh trựng phỏt ra quầng sỏng ở phớa đầu, đú là tinh trựng cũn nguyờn acrosome, những tinh trựng mà acrosome bị tổn thƣơng sẽ khụng cú quầng sỏng này. Kiểm tra trờn
5 vi trƣờng, tớnh số trung bỡnh trong 5 vi trƣờng quan sỏt. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số tinh trựng cũn Acrosome = tổng số tinh trựng đếm đƣợc - Số tinh trựng khụng cũn Acrosome nguyờn vẹn. C ụng t hức t ớnh: Số tinh trựng cũn Acrosome Acrosome (% ) = Tổng số tinh trựng đếm đƣợc
2.4.2. Nghiờn cứu kỹ thuật đụng lạnh tinh dịch lợn
ì 100
Cỏc mẫu tinh sau khi đó đƣợc lựa chọn theo đỳng tiờu chuẩn và đƣợc nghiờn cứu theo phƣơng phỏp phõn lụ so sỏnh để xỏc định kỹ thuật tối ƣu.
Phƣơng phỏp đụng lạnh : theo phƣơng phỏp của Kim In Cheul (Viện nghiờn cứu chăn nuụi Hàn quốc) (2007) [30].
2.4.2.1. Nghiờn cứu ảnh hƣởng của kỹ thuật ly tõm đến sức sống của tinh trựng Phƣơng phỏp tiến hành nhƣ sau:
- Tinh dịch đƣợc kiểm tra đỏnh giỏ cỏc chỉ tiờu chất lƣợng
- Lựa chọn mẫu tinh cú chất lƣợng đạt tiờu chuẩn của kỹ thuật TTNT b. Ly tõm tinh dịch
Chỳng tụi sử dụng mụi trƣờng ly tõm BTS ( Militab) và mụi trƣờng ly tõm VCN (Viện chăn nuụi)
- Thành phần của mụi trƣờng ly tõm: + M ụi t r ƣ ờ ng B T S :
Gluco: 37g; Citrate Na: 6g; EDTA (trilon B): 1,25g; Bicacbonate Na: 1,25g;
KCl: 0,74g. Tất cả pha trong 1000ml nƣớc cất. + M ụi t r ƣ ờ ng V C N :
Gluco 37g; Citrate Na : 5g; EDTA (trilon B): 1,25 g; Bicacbonate Na: 1,25g; KCl : 0,75g. Pha trong 1000ml nƣớc cất
- Pha tinh dịch trong mụi trƣờng ly tõm BTS và VCN tỷ lệ 1:1; nhiệt độ ly tõm: 220C
- Chế độ ly tõm:
+ Chế độ 1: tốc độ ly tõm 1500 v/p, thời gian 15 phỳt + Chế độ 2 : tốc độ ly tõm 2000v/p, thời gian 15 phỳt c. Thu thập tinh trựng sau ly tõm
+ Hỳt bỏ dung dịch phớa trờn trong cỏc ống ly tõm + Lấy phần tinh trựng lắng phớa đỏy ống ly tõm
d. Đỏnh giỏ chất lƣợng tinh trựng sau ly tõm để cú sự so sỏnh về chất lƣợng tinh trựng giữa chế độ ly tõm 1 và 2 cũng nhƣ chất lƣợng tinh trựng sau ly tõm ở hai chế độ so với trƣớc khi ly tõm.
2.4.2.2. Nghiờn cứu kỹ thuật cõn bằng tinh dịch
Phần tinh dịch lắng ở phớa đỏy ống nghiệm đƣợc thu thập, pha loóng với cỏc loại mụi trƣờng đụng lạnh và đƣợc cõn bằng ở cỏc bƣớc :
- Thành phần mụi trƣờng đụng lạnh:
+ M ụ i t r ƣ ờ ng đ ụ ng l ạ nh 1 (L.Y.E .1) gồm: nƣớc cất : 100ml; lactose: 11g; lũng đỏ trứng gà : 25ml; penicilin: 0,029g; streptomycin: 0,076gr.
+ M ụi t r ƣ ờ ng đ ụ ng l ạ nh 2 (L.Y.E. 2) gồm: Dung dịch L.Y.E.1: 91,2%; Glyxerol: 7,5%; OEP:1,3%
Căn cứ vào nồng độ tinh trựng trong 1ml hỗn hợp để quyết định tỷ lệ pha loóng, nồng độ tinh trựng cần đạt đƣợc là 1.109/ml. Tinh dịch thu thập đƣợc sau ly tõm đƣợc pha loóng với mụi trƣờng L.Y.E.1, mức pha loóng bằng 2/3 thể tớch cuối cựng.
- Cõn bằng : hỗn hợp tinh dịch và L.Y.E 1 đƣợc hạ nhiệt độ từ 25oC xuống 5oC (bằng tủ bảo ụn cú trƣơng trỡnh hạ nhiệt độ) trong vũng 2 giờ.
b. Pha loóng và cõn bằng bƣớc 2:
Hỗn hợp sau khi pha loóng và cõn bằng ở bƣớc 1 đƣợc pha loóng với mụi trƣờng L.Y.E.2, mức pha loóng bằng 1/3 thể tớch cuối cựng, dung dịch L.Y.E.2 đƣợc chia làm 4 lần pha với hỗn hợp trờn, mỗi lần cỏch nhau 15 phỳt. Hỗn hợp đƣợc cõn bằng ở nhiệt độ 50C trong 1- 2 giờ.
c. Đỏnh giỏ sức sống tinh trựng ở cỏc lần cõn bằng để so sỏnh sự sai khỏc về chất lƣợng tinh giữa cỏc lần cõn bằng và ở cỏc giống lợn
d. Đúng gúi tinh dịch
Tinh dịch sau cõn bằng bƣớc 2 đƣợc đúng thành cỏc cọng rạ maxi - straw cú thể tớch 5 ml/cọng rạ với tổng số tinh trựng cú trong 1 cọng rạ là 5x 109 tinh trựng (nồng độ 1x 109 tinh trựng/1ml), bằng cỏch dựng seringe hỳt tinh dịch sau đú bơm vào cỏc cọng rạ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.2.3. Nghiờn cứu đụng lạnh tinh dịch trong nitơ lỏng
Cọng rạ chứa tinh dịch đó cõn bằng đƣợc để trong hơi nitơ lỏng, cỏch mặt nitơ lỏng 15cm (nhiệt độ đạt khoảng -79oC) trong thời gian 10 phỳt và 20 phỳt, sau đú đƣợc đƣa xuống nitơ lỏng ở nhiệt độ - 196oC. Sau đú đƣợc bảo
quản lõu dài trong nitơ lỏng. Sau khi bảo quản đỏnh giỏ sức sống của tinh trựng ở cỏc thời gian đụng lạnh khỏc nhau để tỡm ra thời gian đụng lạnh thớch hợp. 2.4.2.4. Nghiờn cứu kỹ thuật giải đụng tinh dịch
Kỹ thuật giải đụng : theo phƣơng phỏp của Kim In Cheul + Kỹ thuật 1 : nhiệt độ 520C, thời gian 45giõy + Kỹ thuật 2 : nhiệt độ 520C, thời gian 30 giõy
Đỏnh giỏ sức sống của tinh trựng ở hai thời gian giải đụng 45 giõy và 30 giõy để tỡm ra thời gian giải đụng tối ƣu nhất.
2.4.3. Nghiờn cứu sử dụng tinh dịch lợn đụng lạnh
2.4.3.1. Nghiờn cứu sử dụng tinh đụng lạnh thụ tinh ống nghiệm
Tinh dịch đụng lạnh sau khi giải đụng đƣợc dựng trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm để tạo phụi.
2.4.3.2. Sử dụng tinh dịch lợn đụng lạnh phối giống cho lợn nỏi trong sản xuất - Giải đụng tinh dịch đụng lạnh
- Pha loóng tinh dịch đó giải đụng trƣớc khi sử dụng : Sử dụng 80 ml mụi trƣờng VCN để pha loóng 5 ml tinh đụng lạnh đó giải đụng để phối giống cho lợn nỏi.
2.5. Phƣơng phỏp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý thống kờ bằng chƣơng trỡnh Excel và phần mềm Minitab 14.0.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiờn cứu về một số chỉ tiờu chất lƣợng tinh dịch lợn trƣớc khi đụng lạnh.
Bảng 3.1: Một số chỉ tiờu chất lƣợng tinh nguyờn trƣớc đụng lạnh
Chỉ tiờu Giống
Landrace (n=84)
(Mean ±SE mean)
Yorkshire (n=60)
(Mean ±SE mean)
Duroc (n=68)
(Mean ±SE mean)
Màu tinh dịch Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa
Mựi tinh dịch Mựi tanh tinh dịch Mựi tanh tinh dịch Mựi tanh tinh dịch
V(ml) 215 ± 13,34** 275 ± 14,24** 285 ± 16,35** Motility (%) 96,04 ± 0,37a 95,24 ± 0,44b 94,88 ± 0,41c A (Progressive Motility %) 85,83 ± 0,64 a 86,07 ± 0,75b 84,13 ± 0,71c Nồng độ C (triệu/ml) 259,15 ± 15,24*** 274,15 ± 16,28*** 214,24±12,45*** VAC (Tỷ) 47,35 ± 12,23*** 64,78 ± 14,54*** 51,21 ± 13,24*** pH 7,34 ± 0,42d 7,35 ± 0,76d 7,41 ± 0,13d Kỳ hỡnh (%) 6,87 ± 0,17e 6,40 ± 0,11f 7,17 ± 0,32g Acrosome % 93,1 ± 4,12h 94,5 ± 3,65i 92,45 ± 3,21k Áp suất thẩm thấu (mosm) 312,05 ± 5,96 m 308,80 ± 6,88n 320,65 ± 6,12o
Ghi chỳ: Trong cựng một dũng, sự sai khỏc giữa cỏc giỏ trị trung bỡnh cú một chữ