3. í NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.3.1. Một số nguyờn lý cơ bản về đụng lạnh tinh dịch
1.3.1.1. Hiện tƣợng đúng băng chất lỏng
Khi chất lỏng bị làm lạnh xuống nhiệt độ quỏ thấp sẽ xảy ra hiện tƣợng đúng băng. Quỏ trỡnh này xảy ra qua cỏc giai đoạn sau:
- Tiền đúng băng - Tạo nhõn tinh thể
- Gión nở của tinh thể băng
- Kết tinh hoàn thiện tại một nhiệt độ nhất định (EP/Entectic point)
EP
EP
Pha lỏng Pha lỏng Pha tinh Pha tinh thể và pha tinh thể thể và pha lỏng S
ơ đồ : Quỏ trỡnh làm lạnh và đúng băng của một dung dịch (Ditto, 1992) [21]
* T i ề n đú ng b ă ng
Là quỏ trỡnh khi làm lạnh một chất lỏng, nếu tốc độ làm lạnh chậm, nhiệt độ của chất lỏng hạ xuống điểm đúng băng mà chất lỏng vẫn giữ nguyờn trạng thỏi và chƣa cú tinh thể đúng băng. Trạng thỏi của chất lỏng lỳc này khụng ổn định, chỉ cần một tỏc động nhẹ là xảy ra hiện tƣợng tạo nhõn hoặc phỏ vỡ hiện tƣợng tạo nhõn tinh thể thay vào đú là hiện tƣợng kết hạt (Ditto, 1992) [21] ; (Weize, 1991) [46].
* H i ệ n t ƣ ợ ng tạo t inh t h ể
Một chất lỏng đúng băng phải cú một hạt nhỏ làm nhõn cho cỏc phõn tử nƣớc lần lƣợt bỏm vào để hỡnh thành tinh thể. Hiện tƣợng tạo nhõn tinh thể cú hai hỡnh thỏi:
+ Nƣớc nguyờn chất: việc tạo nhõn từ hạt tinh thể nƣớc
+ Dung dịch: cỏc hạt chất tan làm nhõn cho cỏc phõn tử nƣớc bao quanh tạo tinh thể. Việc tạo tinh thể ở trƣờng hợp này xảy ra ở nhiệt độ cao hơn trƣờng hợp nƣớc nguyờn chất.
* S ự g i ó n n ở c ủ a t inh t h ể b ă ng
Khi đúng băng cỏc tinh thể hỡnh thành, thể tớch của chỳng sẽ tăng, sự gión nở thể tớch này giải phúng năng lƣợng tiềm ẩn trong cỏc phõn tử nƣớc làm cho nhiệt độ của dung dịch tăng đến điểm đúng băng mặc dự quỏ trỡnh làm lạnh vẫn tiếp tục (Iritani, 1989) [27]. Tại thời điểm đúng băng nhiệt độ của dung dịch khụng đổi trong một giai đoạn nhất định và giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tốc độ đúng băng. Nếu tốc độ đúng băng nhanh thỡ giai đoạn trờn sẽ ngắn lại và sự gión nở của tinh thể sẽ bị loại trừ và thay vào đú là hiện tƣợng tinh thể hoỏ.
* Đ i ể m đ ú ng b ă ng h o à n c hỉnh v à s ự k ế t t inh t inh t h ể c ủ a d ung d ị c h Khi hiện tƣợng làm lạnh tiếp tục, lƣợng tinh thể nƣớc tăng lờn và pha lỏng giảm dần, nồng độ dung dịch tăng và dung dịch sẽ tỏch ra làm 2 phần: pha tinh thể và pha lỏng. Nếu hiện tƣợng làm lạnh tiếp tục thỡ pha lỏng sẽ
biến mất ở một nhiệt độ nhất định. Điểm đú gọi là điểm đúng băng hoàn chỉnh của một dung dịch (Weize, 1991) [46].
1.3.1.2. Ảnh hƣởng của đúng băng lờn tế bào tinh trựng
Tinh trựng là một loại tế bào đặc biệt rất mẫn cảm với cỏc yếu tố ngoại cảnh. Khi đụng lạnh tinh trựng chịu ảnh hƣởng bởi cỏc hiện tƣợng sau:
- Hiện tượng đúng băng nội bào
Tinh trựng bị chết hoặc mất năng lƣợng hoạt động khi cấu tạo nội bào bị phỏ vỡ do việc hỡnh thành tinh thể nƣớc nội bào. Nếu tinh trựng nằm trong dung dịch nƣớc muối sinh lý cú thể loại trừ hiện tƣợng này vỡ đƣợc cỏc phõn tử nƣớc ở dạng lỏng bao quanh mặc dự dung dịch ngoại bào bắt đầu đúng băng ở nhiệt độ -20C đến -50C.
Khi đụng lạnh tinh dịch, sự tạo thành nhõn tinh thể và gión nở của tinh thể băng chỉ xảy ra trong điều kiện đụng lạnh chậm, cũn khi đụng lạnh cực nhanh thỡ hai hiện tƣợng trờn khụng xảy ra mà xảy ra hiện tƣợng tinh thể hoỏ (vitrification) tạo ra cỏc hạt băng nhỏ li ti, loại trừ đƣợc hiện tƣợng gión nở tinh thể (Iritani, 1989) [27]. Do vậy, quỏ trỡnh đúng băng khụng ảnh hƣởng tới tinh trựng.
-Sự mất nước của tế bào tinh trựng
Trong quỏ trỡnh làm lạnh tinh dịch, nƣớc ngoại bào đúng băng làm ASTT chờnh lệch, nƣớc nội bào thoỏt khỏi tinh trựng và tiếp tục đúng băng ở phần ngoại bào.
Ở nhiệt độ 00C đến 50C, nƣớc nội bào và ngoại bào vẫn chƣa đúng băng mà ở trạng thỏi khụng bị đụng lại, ổn định nờn khụng làm ảnh hƣởng đến cấu trỳc tế bào tinh trựng.
Ở khoảng nhiệt độ -20C đến -50C, tinh thể đó đƣợc hỡnh thành trong mụi trƣờng ngoại bào, trong khi nƣớc nội bào khụng bị đụng lại kộo theo sự chờnh lệch cõn bằng hoỏ học gõy hiện tƣợng mất nƣớc tế bào, tế bào bị teo lại.
Ở khoảng nhiệt độ -150C, tế bào tinh trựng cú tới 80% nƣớc nội bào thoỏt ra ngoài dẫn đến hiện tƣợng đúng băng nội bào bị ngăn cản.
Ở khoảng nhiệt độ -300C, phần lớn nƣớc nội bào thoỏt ra khỏi tinh trựng. Vậy tinh trựng cú thể chịu lạnh -300C và cú thể tồn tại ở -1960C. Vấn đề đặt ra là tốc độ làm lạnh phải đủ chậm cho sự mất nƣớc tế bào, trỏnh đúng băng nƣớc nội bào, nhƣng quỏ trỡnh này cũng phải đủ nhanh để trỏnh gõy ra hiện tƣợng chờnh lệch ASTT giữa mụi trƣờng ngoại bào và nội bào, dễ dẫn đến hiện tƣợng mất nƣớc nghiờm trọng. Tuy nhiờn, cũng cú tinh trựng khụng cú khả năng chịu lạnh do cỏc thay đổi lý hoỏ sinh xảy ra ở nhiệt độ thấp, nhƣ biến đổi cấu trỳc nội bào, sự thay đổi cỏc nguyờn tử hydro trong cỏc hợp chất hữu cơ và sự kết tủa protein (Iritani, 1989) [27].
-Hiện tượng đúng băng ngoại bào
Trong quỏ trỡnh đụng lạnh, hiện tƣợng đúng băng nƣớc ngoại bào sẽ xảy ra làm nồng độ dung dịch tăng lờn và ASTT ngoại bào cao hơn ASTT nội bào, pH cũng thay đổi (Iritani, 1989) [27].
- Chuyển động của nước và sự gión nở tinh thể nước gõy ra huỷ hoại cơ học đối với tinh trựng
Quỏ trỡnh giải đụng cũng nhƣ đụng lạnh đều cú tỏc dụng cơ học huỷ hoại tinh trựng do sự chờnh lệch ỏp suất tinh thể, sự di chuyển của nƣớc qua màng tế bào tinh trựng và sự gión nở của cỏc tinh thể nƣớc đỏ hay cỏc bọt khớ giữa cỏc phõn tử nƣớc đỏ gõy ra hiện tƣợng bất thƣờng: mộo mú, vỡ màng... Cỏc tổn thƣơng cơ học này cú thể loại trừ bằng cỏch hạn chế việc hỡnh thành cỏc tinh thể với kớch thƣớc nhỏ nhờ kỹ thuật đúng băng hoặc tan băng với tốc độ nhanh.
1.3.2. Cỏc yếu tố ảnh hưởng tới sức sống tinh trựng trong đụng lạnh
Khi đụng lạnh và giải đụng, do cỏc hiện tƣợng trờn sẽ đe dọa đến sự sống của tinh trựng. Cỏc nhõn tố giỳp tinh trựng tồn tại sau khi đụng lạnh và giải đụng:
-Khả năng chịu lạnh của tinh trựng
Khả năng chịu lạnh của tinh trựng là tỷ lệ sống sút của tinh trựng sau khi giải đụng. Điều này phụ thuộc vào: giống, độ tuổi lấy tinh, mựa vụ lấy tinh...
-Thành phần mụi trường pha loóng
Mụi trƣờng pha loóng bao gồm: chất cú năng lƣợng, chất đệm, chất chống đụng, chất điện giải... Tỷ lệ tinh trựng sau đụng lạnh và giải đụng phụ thuộc vào cỏc thành phần trờn, nếu việc pha chế mụi trƣờng khụng hợp lý sẽ làm giảm hoạt lực, tăng tỷ lệ chết của tinh trựng.
- Thời gian cõn bằng
Tinh trựng sau khi ra ngoài cơ thể rất dễ bị sốc nhiệt do sự chờnh lệch giữa nhiệt độ trong cơ thể và nhiệt độ mụi trƣờng ngoài cơ thể. Chớnh vỡ vậy cần thiết phải hạ nhiệt độ từ từ để tinh trựng làm quen với nhiệt độ thấp. Theo Ditto (1992) [21] cho biết: thời gian cõn bằng khoảng 3 - 5h ở nhiệt độ 50C để tinh trựng làm quen với nhiệt độ thấp.
-Tốc độ đụng lạnh
Khi đụng lạnh sõu để tinh trựng đúng băng, tốc độ đụng lạnh nhanh hay chậm quyết định đến hoạt lực tinh trựng sau giải đụng. Ở nhiệt độ -20C, nƣớc nội bào và ngoại bào vẫn giữ nguyờn pha lỏng, chƣa đúng băng thành dạng tinh thể, tế bào tinh trựng chƣa bị ảnh hƣởng. Ở nhiệt độ -50C, nƣớc ngoại bào bắt đầu đúng băng, nồng độ chất tan ngoại bào tăng lờn, ỏp suất tinh thể chờnh lệch, một phần nƣớc nội bào thoỏt ra ngoài và tiếp tục biến thành tinh thể băng. Ở nhiệt độ -100C xảy ra 3 trƣờng hợp phụ thuộc tốc độ đụng lạnh (Iritani, 1989) [27]:
+ Đụng lạnh chậm: nƣớc ngoại bào đúng băng, nƣớc nội bào thoỏt ra ngoài, tế bào tinh trựng mất nhiều nƣớc và teo lại.
+ Đụng lạnh nhanh: khi khụng đủ thời gian để nƣớc nội bào thoỏt ra khỏi tinh trựng, nờn nƣớc ngoại bào và nƣớc nội bào cựng đúng băng ở dạng
+ Đụng lạnh rất nhanh: khi nƣớc nội bào khụng kịp thoỏt ra ngoài và do tốc độ đúng băng rất nhanh, nƣớc nội bào và nƣớc ngoại bào khụng kịp kết tinh dạng tinh thể mà xảy ra hiện tƣợng thuỷ tinh hoỏ. Kớch thƣớc của tất cả cỏc tinh thể nƣớc nội bào và ngoại bào đều rất nhỏ ở dạng li ti nờn khụng cú sự gión nở về thể tớch, giữ đƣợc ỏp suất thể tớch đẳng trƣơng. Do đú, tinh trựng vẫn giữ nguyờn hỡnh thỏi và cấu trỳc.
-Giải đụng
Tinh cọng rạ đƣợc giải đụng trong nƣớc ấm. Nhiệt độ và thời gian giải đụng phải đồng thời đỏp ứng đƣợc hai yờu cầu là “đỏnh thức” tinh trựng đang ở trạng thỏi tiềm sinh chuyển sang trạng thỏi hoạt động và khụng làm ảnh hƣởng đến hoạt lực của tinh trựng. Do đú, cần phải giải đụng nhanh, nhiệt độ giải đụng phải đảm bảo để tinh trựng khụng phải chịu đựng pha kết tinh hoỏ đồng thời khụng phỏ vỡ cấu trỳc của tinh trựng.
- Bảo quản
Tinh trựng sau đụng lạnh luụn phải đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng (-1960C). Nếu bảo quản tốt, tinh trựng sau bảo quản hàng chục năm khi giải đụng vẫn cú khả năng thụ thai.
Ở Thụy Sĩ: tinh trựng bũ bảo quản 20 năm vẫn cú khả năng thụ thai. Ở Nhật Bản: tinh cọng rạ gia sỳc bảo quản sau 4 - 13 năm, sức hoạt động 45 - 55%, tỷ lệ thụ thai 54% (Hiroshi Masuda, 1994) [26]. Bằng phƣơng phỏp bức xạ thỡ tinh trựng cú thể tồn tại đến 400 năm (Majur, 1989) [31].
1.3.3. Cơ sở khoa học của mụi trường đụng lạnh tinh dịch lợn
Kỹ thuật đụng lạnh đƣợc tiến hành trong thời gian dài, điều kiện nhiệt độ rất thấp. Vỡ vậy, cỏc mụi trƣờng sử dụng trong đụng lạnh cần phải đỏp ứng đƣợc cỏc yờu cầu nhƣ: cung cấp năng lƣợng cho tinh trựng; độ pH, ASTT phải cõn bằng tƣơng đối với pH và ASTT của tinh trựng; tăng cƣờng cỏc chất đệm
để duy trỡ pH; cú cỏc chất cú tỏc dụng bảo vệ tinh trựng trong điều kiện nhiệt độ thấp và trỏnh cho tinh trựng khụng bị tấn cụng bởi cỏc vi sinh vật gõy hại.
Tinh thanh là mụi trƣờng sống của tinh trựng nhƣng lại là một trở ngại lớn trong cụng nghệ đụng lạnh tinh dịch. Vỡ trong tinh thanh khụng chứa thành phần chống lạnh và cú một lƣợng nƣớc rất lớn (tinh dịch ngựa và lợn là nhiều hơn cả trong cỏc loài gia sỳc) sẽ gõy ra hiện tƣợng kết tinh. Do đú phải rỳt nƣớc và loại bỏ nƣớc thay vào đú là một mụi trƣờng đụng lạnh tổng hợp cú những tớnh chất húa lý tƣơng đồng ớt kiềm tớnh hơn, bao gồm cú cỏc chất điện giải, chất khụng điện giải và chất chống lạnh. Từ đú giỳp cho tinh trựng sau bảo tồn đƣợc nguyờn vẹn để cú khả năng thụ thai và sinh ra đời sau một cỏch bỡnh thƣờng.
Một số nguyờn tắc cơ bản của mụi trƣờng đụng lạnh tinh dịch lợn:
- Áp suất thẩm thấu
Để tinh trựng tồn tại đƣợc trong mụi trƣờng pha loóng tinh dịch thỡ ASTT của dung dịch mụi trƣờng đụng lạnh (ASTT ngoại bào) phải tƣơng đồng với ASTT bờn trong của tinh trựng (ASTT nội bào), tức là dung dịch mụi trƣờng phải đẳng trƣơng. Nhƣ vậy tinh trựng mới giữ vững đƣợc hỡnh thỏi học và cú khả năng tiến hành trao đổi chất bỡnh thƣờng. Trƣờ ng hợp mụi trƣờng dung dịch ƣu trƣơng (ASTT ngoại bào lớn hơn ASTT nội bào) hoặc nhƣợc trƣơng (ASTT ngoại bào nhỏ hơn ASTT nội bào) sẽ gõy ra hiện tƣợng teo hoặc trƣơng phồng, cú thể làm vỡ cấu trỳc tinh trựng.
Trong thực tiễn sản xuất, ASTT của tinh dịch vật nuụi cú biến động ngay cựng một cỏ thể giữa cỏc lần lấy tinh khỏc nhau. Vỡ vậy, khụng phải lỳc nào mụi trƣờng cũng đều đẳng trƣơng so với tinh dịch và tinh trựng. Đõy cũng là một nguyờn nhõn gõy lờn khú khăn trong bảo tồn tinh dịch. Tuy nhiờn tinh trựng vẫn cú thể chịu đƣợc khoảng cỏch chờnh lệch nhất định ấy nhờ vào sự thớch ứng tạm thời của màng lọc tinh trựng với độ bền thẩm thấu.
- Đường trong mụi trường đụng lạnh tinh dịch
Trong mụi trƣờng đụng lạnh thƣờng sử dụng cỏc loại đƣờng nhƣ: Glucose, fructose, lactose.
- Chất phũng vệ lạnh (chất ''chống lạnh'' cho tinh trựng)
Khả năng chịu lạnh của tinh trựng rất kộm. Mặt khỏc, kỹ thuật đụng lạnh đũi hỏi phải tiến hành trong điều kiện nhiệt độ rất thấp. Vỡ vậy, cần thiết phải bổ sung vào mụi trƣờng đụng lạnh chất cú tỏc dụng bảo vệ (protecter) cho tinh trựng, hạn chế tối đa hiện tƣợng sốc nhiệt. Cỏc chất đú là: lũng đỏ trứng gà, cỏc dạng chế phẩm của phospholipid, glyxeryl… (Nguyễn Thiện và ctv, 2006) [14].
+ Glyxeryl : Cụng thức C3H5(OH)3; Khối lƣợng phõn tử: 92,09
Glyxeryl cú tỏc dụng nhƣ một chất chống lạnh, cú độc tớnh nhẹ, khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, tan mạnh trong nƣớc và cồn. Glyxeryl là dung mụi tốt cho cỏc chất điện giải và hợp chất hữu cơ, làm giảm tinh thể nƣớc. Trong mụi trƣờng đụng lạnh, glyxeryl ngấm vào tinh trựng thay thế nƣớc bị mất và làm tinh trựng khụng bị teo.
Glyxeryl làm cho nƣớc đúng băng ở dạng hạt nhỏ, loại trừ đƣợc sự gión nở của tinh thể nƣớc nội bào, chống đƣợc sự phỏ vỡ tế bào.
Glyxeryl giữ đƣợc sự ổn định về nồng độ của cỏc chất hũa tan, khụng làm thay đổi ASTT và hạn chế việc phỏ hủy cỏc protein của tinh trựng.
+ Lũng đỏ trứng: lũng đỏ trứng cú tỏc dụng ''bảo vệ'' cho tinh trựng chống đƣợc hiện tƣợng choỏng lạnh, chức năng này đƣợc thực hiện nhờ một dạng lipit của lũng đỏ trứng. Trong lũng đỏ trứng gà lipit chiếm 32,6%. Lipit lũng đỏ trứng gà cú cấu tạo phức tạp, thành phần của chỳng gồm: glyxeryl 62,3%, photpholipit 32,8%, steron 4,9% (Nguyễn Tấn Anh, 1996) [3].
Độ pH của lỏng đỏ trứng hơi toan (pH 6 - 6,7), nờn khi pha lũng đỏ trứng vào mụi trƣờng cú thể làm giảm pH của mụi trƣờng xuống hơi toan. pH này cú lợi cho tinh trựng.
- Chất khỏng khuẩn trong mụi trường
Để hạn chế tỏc hại của vi khuẩn với tinh trựng ngƣời ta bổ sung vào mụi trƣờng cỏc chất khỏng khuẩn với nồng độ thớch hợp. Cỏc chất khỏng khuẩn gồm: penicillin, streptomycin, amykacin.
- Chất ''rửa sạch'' mụi trường
Trong tinh thanh của tinh dịch gia sỳc cú những kim loại đa húa trị nhƣ Ca, Mg… Theo Mann (1956) (trớch dẫn theo Telesforo Bonadonna, 1967) [49] và Hefez (1960) trớch dẫn theo Lờ Xuõn Cƣơng(1985) [5] thỡ trong tinh dịch lợn cú chứa: Ca 5mg/100ml; Mg 11mg/100ml. Chớnh những nguyờn tố này làm tăng cƣờng quỏ trỡnh chuyển húa của tinh trựng thụng qua hoạt húa cỏc enzym trong tinh trựng. Trong bảo tồn tinh dịch cần vụ hiệu húa tỏc hại của cỏc nguyờn tố trờn. Do đú, trong một số mụi trƣờng đụng lạnh đều cú Trilon B (EDTA).
Cụng thức của EDTA: Na2C10H14N2O8.2H2O
EDTA trong mụi trƣờng cú một số cụng dụng nhƣ: liờn kết cỏc cation kim loại cú trong tinh dịch (Ca+ +, Mg+ +...) tạo lờn phức vụ hại đối với tinh trựng. Nú cũn cú khả năng kỡm hóm hoạt động của một số vi khuẩn và nhiều loại enzym cú hại cho tinh trựng, hạn chế quỏ trỡnh trao đổi chất trong tinh dịch (nhất là quỏ trỡnh phõn huỷ), giỳp cho tinh trựng duy trỡ hàm lƣợng ATP, ADP ở mức độ cao, duy trỡ đƣợc trạng thỏi tiềm sinh của tinh trựng. Do đú bảo vệ đƣợc acrosomee của tinh trựng khụng bị phỏ huỷ (Plitsơcụ N.T, 1965; Xerơđiuc X. I, 1971). Trớch dẫn theo Nguyễn Tấn Anh [4].
- Chất bảo vệ màng của tinh trựng
Trong đụng lạnh tinh dịch, màng tinh trựng là cấu trỳc dễ bị tổn thƣơng nhất. Để hạn chế sự phỏ vỡ của màng tinh trựng trong đụng lạnh tinh dịch cần
thiết phải bổ sung chất cú tỏc dụng tăng cƣờng khả năng chịu đựng của màng.