2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO VÀ CÔ LẬP HỢP CHẤT
Bột khô thân cây cà phê robusta, Coffea canephora (30 kg) được ngâm với
MeOH ở nhiệt độ phòng trong 72 h. Dịch chiết MeOH được lọc và làm bay hơi dung môi dưới áp suất kém thu được cao chiết MeOH (1.4 kg). Phần cao chiết này được hoà tan trong n-hexane. Phần dịch tan trong n-hexane được cô đặc đến khối lượng
không đổi trong máy cô quay để thu được cao n-hexane (H, 300 g). Phần khơng tan trong n-hexane được hồ tan trong EtOAc thu được dịch chiết EtOAc. Sau khi thu
hồi dung môi dịch chiết EtOAc thu được cao chiết EtOAc (180 g). Phần không tan trong EtOAc thực hiện tương tự với MeOH để thu được cao chiết MeOH (360 g)
Phần cao n-hexane (H, 300 g) được tách thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (EtOAc)
17 (85:15 đến 50:50), kết quả thu được bảy phân đoạn chính (H1-H7). Phân đoạn H4 (8.87 g) được tách bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi tăng dần n-
hexane/EtOAc (8:2 đến 0:1) để thu được bảy phân đoạn (H4.1-H4.7). Phân đoạn H4.3 (0.92 g) được cho qua cột silica gel giải ly bằng n-hexane/EtOAc (9:1) để thu được KK01 (20 mg). Phân đoạn H4.4 (0.71 g) được qua cột sắc ký silica gel với hệ dung môi tăng dần CHCl3/acetone (100:0 đến 97:3) thu được 3 phân đoạn (H4.4.1-H4.4.3). Phân đoạn H4.4.1 (0.043 g) được cho qua cột sắc ký silica gel với hệ dung môi giải ly CHCl3/acetone (9:1), sau đó tinh chế bằng cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi CHCl3/MeOH (1:4) thu được HN1 (10 mg). Phân đoạn H4.4.3 (0.140 g) được tinh chế bằng cột silica gel với hệ CHCl3/acetone (9:1), sau đó qua cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi CHCl3/MeOH (1:4) thu được HN2 (81 mg).
Phân đoạn H6 (5.47 g) được sắc ký cột với silica gel dùng hệ dung môi n-
hexane/EtOAc (7:3) thu được bảy phân đoạn (H6.1-H6.7). Phân đoạn H6.5 (1.75 g) được cho lên cột silica gel, sử dụng dung môi n-hexane/acetone (8:2 đến 5:5) để thu được năm phân đoạn (H6.5.1-H6.5.5). Hợp chất Y01 (6 mg) được cô lập từ phân đoạn H6.5.3 (0.870 g) bằng sắc ký cột silica gel giải ly bằng n-hexane/EtOAc (9:1).
2.4. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ALPHA-GLUCOSIDASE
Thử nghiệm hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện theo quy trình của Apostolidis với một số điều chỉnh [34]. Hỗn hợp phản ứng gồm 60 µL dung dịch đệm phosphate (100 mM, pH 6.8), 20 µL mẫu thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau và 20 µL of a-glucosidase (0.3 IU/mL) được bơm vào đĩa 96 giếng và được ủ ở 37 oC trong 10 phút. Sau đó, thêm vào hỗn hợp này 100 µL dung dịch p-nitrophenyl-α-D-
glucopyranoside (200 µM) pha trong đệm phosphate. Tiếp theo ủ hỗn hợp phản ứng ở 37 oC trong 30 phút. Cuối cùng, thêm vào hỗn hợp này 50 µL dung dịch NaOH (50 mM). Độ hấp thụ của p-nitrophenol (pNP) được đo ở bước sóng 405 nm trên máy
ELX800 (BIOTEX). Acarbose được sử dụng như mẫu đối chứng dương.
𝐼(%) = !!"#$%"&"!'()*&+
!!"#$%"& 𝑥100%
Acontrol: độ hấp thụ của mẫu chuẩn (khơng có tác nhân ức chế) Asample: độ hấp thụ của mẫu thử nghiệm
Nồng độ ức chế 50% enzyme (IC50) được xác định bằng đường cong hiệu chỉnh giữa phần trăm ức chế và nồng độ mẫu với phần mềm Tablecurve. Giá trị IC50 được xác định từ ba lần thử nghiệm cho mỗi mẫu.
Các thí nghiệm thử nghiệm hoạt tính ức chế a-glucosidase được thực hiện tại Phịng Thí nghiệm Sinh hố, Khoa Cơng nghệ Sinh học, Trường ĐH Mở Tp. HCM, Số 68 Lê Thị Trung, P. Phú Lợi, Tp. Thủ Dầu Một, Tình Bình Dương.
18
19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Từ việc khảo sát thành phần hóa học của cao n-hexane từ thân cây cà phê
robusta, Coffea canephora chúng tôi đã phân lập được 4 hợp chất triterpene.
3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT HN01
Hợp chất HN1 (10 mg) thu được từ phân đoạn H4.4.1 (Sơ đồ 2.1), có những đặc điểm như sau:
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Nhiệt độ phân huỷ 280oC.
Phổ HR-ESI-MS mảnh ion phân tử giả ở m/z 513.3561 [M-H]- (Phụ lục 1a). Phổ FT-IR nmax (film) cm-1: 3508, 2940, 1725, 1251 (Phụ lục 1b).
Phổ 1H–NMR (CDCl3, 500 MHz) (Phụ lục 1c và Bảng 3.1). Phổ 13C–NMR (CDCl3, 125 MHz) (Phụ lục 1d và Bảng 3.1). Phổ 1H–1H COSY NMR (CDCl3) (Phụ lục 1e). Phổ HSQC NMR (CDCl3) (Phụ lục 1f). Phổ HMBC NMR (CDCl3) (Phụ lục 1g). Phổ NOESY NMR (CDCl3) (Phụ lục 1h).
Hợp chất HN1 có phổ HR-ESI-MS cho mảnh ion phân tử giả ở m/z 513.3561 [M-H]- phù hợp công thức phân tử C32H50O5. Phổ FT-IR của hợp chất 1 thể hiện các dãi hấp thu tương ứng các nhóm định chức hydroxyl (3508 cm-1) và ester carbonyl (1725, 1251 cm-1). Trên phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu đơi-đơi ở d 4.44 (J = 11.5 và 4.5 Hz, H-3), của proton trên nhóm methine bị oxygen hố. Một proton trên nhóm methine mang nhóm hydroxy khác được tìm thấy với tín hiệu mũi đơn rộng tại d 4.53 (H-6). Tín hiệu giống mũi ba triplet trong vùng downfield nhất tại d 5.31 (J = 3.0 Hz, H-12) thuộc về proton olefin. Một tín hiệu doublet-doublet đặc trưng ở d 2.82 (J = 14.0 và 4.0 Hz, H-18) được gán cho proton trên carbon bậc ba đặc trưng C-18. Sự acetyl hố tại nhóm hydroxyl trên C-3 được xác định bởi tín hiệu mũi đơn ứng với 3H tại d 2.05 (H-2'), trong khi đó bảy tín hiệu mũi đơn với 3H cho mỗi tín hiệu ở d 1.32, 1.25, 1.09, 1.06, 0.95, 0.92 và 0.90 được gán cho các proton methyl lần lượt tại C-25, C-24, C-27, C-26, C-23, C-30 và C-29. Tóm lại, tín hiệu proton olefin và bảy tín hiệu mũi đơn methyl trên phổ 1H NMR của HN1 cho thấy đặc trung của khung sườn Δ12-oleanane.
Phổ 13C NMR cho thấy các tín hiệu cộng hưởng của 32 carbon. Các tín hiệu cộng hưởng ở vùng downfield tại d 183.8 và 171.2 được gán cho các nhóm carboxyl và ester carbonyl carbon. Các proton olefin C-13 và C-12 được phát hiện với các tín hiệu tại d 142.9 và 122.9 tương ứng. Phổ cũng cho thấy hai carbon mang oxygen tại
20
d 81.0 và 68.7, đề nghị cho các tín hiệu cộng hưởng lần lượt tại C-3 và C-6. Từ các
thông tin trên, dữ kiện phổ 13C NMR phù hợp với khung sườn Δ12 oleanene [35] (Mahato & Kundu 1994).
Phổ COSY và HSQC cung cấp các thơng tin gắn kết các tín hiệu trên phổ 1H NMR và 13C NMR nhằm xác định cấu trúc hợp chất HN1. Ngoài ra, phổ HMBC thể hiện mối tương quan giữa proton và carbon qua hai hoặc ba nối (Hình 3.1). Proton H-2' (d 2.05) và H-3 (d 4.44) cho tương quan HMBC với C-1' (d 171.2), chỉ ra vị trí nhóm O-acetyl tại C-3. Sự hiện diện của nhóm hydroxyl tại C-6 được xác định bởi
tương quan HMBC giữa H-5 (d 0.85), H-7 (d 1.49) và C-6 (d 68.7).