Cấu trúc của hợp chất Y01 được xác định là sumaresinolic acid phù hợp với dữ liệu phổ nghiệm theo tài liệu tham khảo.[36] Và cấu trúc này phù hợp với cơng thức phân tử C30H48O4 theo tín hiệu trên phổ ESI-MS với mảnh ion phân tử giả ở m/z 471.23 [M-H]-. Do vậy, hợp chất Y01 được xác định là sumaresinolic acid (Hình 3.5).
26
3.3. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT HN2
Hợp chất HN2 (81 mg) thu được từ phân đoạn H4.4.3 (Sơ đồ 2.1), có những đặc điểm như sau:
Chất bột vơ định hình, màu trắng.
Phổ ESI-MS mảnh ion phân tử giả ở m/z 455.29 [M-H]- (Phụ lục 3a). Phổ 1H–NMR (CDCl3, 500 MHz) (Phụ lục 3b và Bảng 3.1).
Phổ 13C–NMR (CDCl3, 125 MHz) (Phụ lục 3c và Bảng 3.1). Phổ HSQC NMR (CDCl3) (Phụ lục 3d).
Phổ HMBC NMR (CDCl3) (Phụ lục 3e).
Phổ 1H-NMR của hợp chất HN2 cho thấy có bảy tín hiệu mũi đơn lần lượt tại các vị trí d 0.75 (s, 3H); 0.77 (s, 3H); 0.90 (s, 3H); 0.91 (s, 3H); 0.93 (s, 3H); 0.99 (s, 3H); 1.13 (s, 3H) là các tín hiệu đặc trưng cho bảy nhóm methyl gắn với carbon tứ cấp. Ngồi ra, một tín hiệu mũi ba ở vị trí d 5.28 (t-like, 1H, J = 3.5 Hz) là tín hiệu proton olefine. Bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR cịn xuất hiện một số tín hiệu tại vị trí
d 3.23 (dd, 1H, J = 11.5; 4.5 Hz) của proton trên carbon methine bị oxygen hố và tín
hiệu ở d 2.82 (dd, 1H, J = 14.0; 4.0 Hz) là đặc trưng cho proton H-18 của triterpene. Phổ 13C-NMR (CDCl3) cho thấy: Có 30 carbon, trong đó có bốn carbon ở vùng trường thấp tại δ 183.5 của nhóm -COOH; 143.7 của nhóm >C=; 122.8 của nhóm
=CH- và 79.2 của nhóm >CH-OH. Hai mươi sáu carbon cịn lại nằm trong vùng trường cao với δ 15.5-53.4.
Từ những đặc điểm trên có thể thấy hợp chất HN2 này thuộc khung triterpene cụ thể hơn là khung oleanane với một nhóm -COOH, một nhóm -OH gắn trên vịng và một nối đôi.
Phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR của HN2 tương tự phổ của hợp chất HN1 chỉ có điểm khác biệt là sự vắng mặt của nhóm acetyl tại vị trí C3 và nhóm hydroxyl tại vị trí C-6 (Bảng 3.1). Các tín hiệu trên phổ được gán cho các vị trí trên cấu trúc dựa vào các phổ HSQC và phổ HMBC. Hình 3.6 trình bày một số tương quan HMBC quan trọng.
Cấu trúc của hợp chất HN2 được xác định là olenanolic acid phù hợp với dữ liệu phổ nghiệm theo tài liệu tham khảo.[35] Và cấu trúc này phù hợp với cơng thức phân tử C30H48O3 theo tín hiệu trên phổ HR-ESI-MS với mảnh ion phân tử giả ở m/z 455.29 [M-H]-. Do vậy, hợp chất HN2 được xác định là oleanolic acid (Hình 3.7).
27
Hình 3.6. Một số tương quan HMBC quan trọng trong HN2
Hình 3.7. Cấu trúc hoá học của HN2, oleanoic acid
3.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC HỢP CHẤT KK01
Hợp chất KK01 (20 mg) thu được từ phân đoạn H4.3 (Sơ đồ 2.1), có những đặc điểm như sau:
Chất bột vơ định hình, màu trắng.
Phổ ESI-MS mảnh ion phân tử giả ở m/z 497.21 [M-H]- (Phụ lục 4a). Phổ 1H–NMR (acetone-d6, 500 MHz) (Phụ lục 4b và Bảng 3.1). Phổ 13C–NMR (acetone-d6, 125 MHz) (Phụ lục 4c và Bảng 3.1). Phổ 13C–DEPT-NMR (acetone-d6, 125 MHz) (Phụ lục 4d). Phổ HSQC NMR (acetone-d6) (Phụ lục 4e).
28 Dữ liệu phổ 1H-NMR (acetone-d6) cho thấy có sáu tín hiệu cộng hưởng mũi đơn lần lượt tại vị trí d 0.82 (s, H-26); 0.87 (s, H-23 và H-24); 0.92 (s, H-29); 0.94 (s, H- 30); 0.98 (s, H-25); 1.19 (s, H-27) là tín hiệu của 7 nhóm methyl gắn trên carbon tứ cấp. Trên phổ 1H-NMR cịn xuất hiện một tín hiệu mũi đơn tương ứng với ba proton tại d 1.99 (s, H-2’), độ dịch chuyển hóa học của tín hiệu này dời về vùng trường thấp chứng tỏ đây là nhóm methyl cạnh nhóm hút điện tử, dự đốn đây là nhóm methyl thuộc một nhóm acetyl. Ngồi ra, trên phổ 1H-NMR cịn có sự hiện diện của một tín hiệu tại d 4.45 (dd, J=11.5; 4.5 Hz, H-3) là tín hiệu của nhóm oxymethine; có một tín hiệu mũi ba ở vị trí d 5.25 (t-like, J=3.5Hz, H-12) là tín hiệu nhóm methine olefine mang một nhóm thế.
Phổ 13C và DEPT-NMR cho biết KK01 có 32 carbon, bao gồm 8 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 5 nhóm CH và 9 carbon bậc 4. Các tín hiệu tại δ 179.0 (C-28) và δ 170.7 (C-1’) thuộc về hai nhóm carboxyl; δ 145.0 (C-13) là carbon olefine mang hai nhóm thế; δ 122.9 (C-12) là nhóm methine olefine mang 1 nhóm thế; δ 81.1 (C-3) là nhóm oxymethine; 27 carbon cịn lại nằm trong vùng δ 15.7 – 56.0 ppm là các carbon bão hịa.
Từ những đặc điểm trên có thể nhận thấy hợp chất KK01 thuộc nhóm hợp chất triterpenoid, có khung oleanane. Sự hiện diện của nhóm carboxyl trong hợp chất KK01 có khung sườn oleanane cho phép dự đoán đây là dẫn xuất của oleanolic acid. Phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR của KK01 tương tự phổ của hợp chất HN2 chỉ có điểm khác biệt là sự có mặt của nhóm acetyl tại vị trí C-3 (Bảng 3.1). Các tín hiệu trên phổ được gán cho các vị trí trên cấu trúc dựa vào các phổ HSQC và phổ HMBC. Hình 3.8 trình bày một số tương quan HMBC quan trọng.
29 Cấu trúc của hợp chất KK1 được xác định là 3-O-acetylolenanolic acid (Hình 3.9) phù hợp với dữ liệu phổ nghiệm theo tài liệu tham khảo.[37] Và cấu trúc này phù hợp với cơng thức phân tử C32H50O4 theo tín hiệu trên phổ ESI-MS với mảnh ion phân tử giả ở m/z 497.21 [M-H]-.
Hình 3.9. Cấu trúc hố học của KK01, 3-O-acetyloleanolic acid 3.5. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ALPHA-GLUCOSIDASE
Các cao chiết (cao n-hexane, cao EtOAc, cao MeOH) và bốn hợp chất cô lập (HN1, Y01, HN2, KK01) được thử nghiệm in vitro nhằm đánh giá hoạt tính ức chế α-glucosidase. Hoạt tính này được thể hiện qua giá trị IC50 (μM và µg/mL) được trình bày trong Bảng 3.2 và Bảng 3.3, và so sánh với acarbose, được sử dụng như đối chứng dương. Cả bốn hợp chất đều ức chế α-glucosidase với giá trị IC50 trong khoảng từ 83 đến 203 μM. Cao n-hexane có IC50 = 13.5 µg/mL. Trong tất cả các trường hợp, các hợp chất đều có hoạt tính cao hơn đối chứng dương acarbose (IC50 = 209.8±0.3 µM # 135.4 µg/mL). Hợp chất HN1 (IC50 = 83.0±1.2 µM) và và KK01 (IC50 = 146.9±1.2
µM) mang nhóm acetyl (CH3CO-) ở vị trí số C-3 thể hiện hoạt tính cao hơn hợp chất
Y01 (IC50 = 193.1±0.6 µM) và hợp chất HN2 (IC50 = 202.7.0±0.9 µM) có mang nhóm hydroxyl (-OH). Sự hiện diện của nhóm hydroxyl tại C-6 dẫn đến kết quả hoạt tính ức chế α-glucosidase tốt hơn. Hoạt tính ức chế cao nhất của hợp chất HN1 có thể do sự hiện diện của cả nhóm acetyl và nhóm hydroxyl lần lượt tại C-3 và C-6. Hợp chất Y01 có chứa nhóm hydroxyl tại C-6 trong khi hợp chất HN2 thì khơng, và hai hợp chất này đều có hoạt tính thấp hơn so với HN1 và KK01. Điều này cho thấy sự acetyl
30 hố nhóm hydroxyl tại C-3 và sự hiện diện nhóm hydroxyl -OH tại C-6 trong khung oleanane góp phần làm nâng cao hoạt tính chống đái tháo đường.
Bảng 3.2. Giá trị IC50 khả năng ức chế a-glucosidase của các cao chiết
Cao chiết IC50 (µg/mL) Cao n-hexane 13.5±0.3 Cao EtOAc 417.5±0.4 Cao MeOH 226.9± 0.3 Acarbose 135.4± 0.2
Bảng 3.3. Giá trị IC50 khả năng ức chế a-glucosidase của các hợp chất cô lập
Hợp chất IC50 (µM) HN1 83.0±1.2 Y01 193.1±0.6 HN2 202.7± 0.9 KK01 146.9± 1.2 Acarbose 209.8± 0.3
31
KẾT LUẬN
Từ thân cây cà phê robusta, Coffea canephora (Rubiaceae) thu hái ở Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng, sử dụng phương pháp trích ly ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, cùng các phương pháp sắc ký cột silica gel pha thường và sephadex đã cô lập được 4 hợp chất tinh khiết. Sử dụng các phương pháp hóa lý hiện đại như HR–ESI–MS, FT-IR, 1D và 2D–NMR và so sánh với các tài liệu tham khảo, chúng tôi đã xác định được cấu trúc hóa học của 4 hợp chất triterpene khung oleanane là coffecanolic acid (HN1), sumaresinolic acid (Y01), oleanolic acid (HN2), và 3-O-acetyloleanolic acid (KK01). Những hợp chất này lần đầu tiên được biết có hiện diện trong cây cà phê robusta,
Coffea canephora, hợp chất coffeanolic acid được cô lập lần đầu tiên trong tự nhiên.
Cao n-hexane và cả bốn hợp chất đều thể hiện hoạt tính ức chế a-glucosidase. Hợp chất HN1 có hoạt tính cao nhất và gấp 2.5 lần so với chứng dương acarbose (IC50 = 209.8±0.3 µM) trong thử nghiệm này.
Việc nghiên cứu cô lập và xác định cấu trúc hóa học nhóm hợp chất triterpene khung oleanane nhằm cung cấp thêm thơng tin về thành phần hóa học của cây cà phê robusta, Coffea canephora (Rubiaceae) nói riêng và chi Coffea nói chung. Hoạt tính ức chế a-glucosidase của các hợp chất triterpene cô lập được cho thấy đây là nguồn dược liệu tiềm năng cho các nghiên cứu về chống bệnh đái tháo đường.
R1 R2
OAc OH 3β-Acetoxy-6β-hydroxy-olean-12-en-28-oic acid (HN1) OH OH Sumaresinolic acid (Y01)
OH H Oleanoic acid (HN2)
32 Ngồi ra, kết quả nghiên cứu cịn trở thành tài liệu cho các bài giảng chuyên môn về phân lập hợp chất hữu cơ và các phương pháp phổ nghiệm được giảng dạy tại Khoa Cơng nghệ Hố học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh. Nghiên cứu này góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu cho nhóm tác giả trong lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên, từ đó phục vụ đắc lực cho việc giảng dạy các môn học chuyên ngành tại trường.
Kết quả nghiên cứu đã được cơng bố trên tạp chí chun ngành quốc tế. Thông tin nghiên cứu đăng tải trên bài báo góp phần chia sẻ kiến thức về thành phần hóa học của cây cà phê robusta, Coffea canephora cho những nhà nghiên cứu cùng hướng
chuyên ngành. Bên cạnh đó kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các loại cao chiết và chất tinh khiết sẽ góp phần định hướng sử dụng hiệu quả thân cây cà phê, một nguồn sinh khối xem như bỏ đi sau thời gian thu hoạch trái cà phê. Bên cạnh đó đây cũng là thơng tin giúp các nhà nghiên cứu về tổng hợp hữu cơ đưa ra ý tưởng tổng hợp hoặc bán tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học từ phịng thí nghiệm, xa hơn là định hướng phục vụ công nghiệp dược phẩm.
Bài báo đăng trong tạp chí chuyên ngành quốc tế sẽ làm tăng uy tín học thuật cho trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. HCM.
Đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo:
Qua các kết quả nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy rằng nhóm hợp chất triterpene là nhóm hợp chất hiện diện trong loài cà phê Coffea canephora với nét đặc trưng của các cây thuộc loài Coffea. Bên cạnh đó, nhóm hợp chất diterpene, cũng là nhóm hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng và bước đầu phát hiện sự hiện diện của chúng trong qúa trình khảo sát. Do vậy, đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo cô lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học nhóm hợp chất diterpene.
Kết quả nghiên cứu:
Kết quả nghiên cứu đã được công bố một bài báo trên Natural Product Research thuộc tạp chí chuyên ngành quốc tế trong hệ thống SCIE, Q2,
Minh Hao Hoang, Thi Anh Tuyet Nguyen, Nguyen Kim Tuyen Pham, Van Son Dang, Thi Nga Vo (2021), “A new oleanane-skeleton triterpene isolated from Coffea
33
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Pham HH (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ Thành phố Hồ Chí Minh, 3, 175- 176.
[2] Patay E.B., Bencsik T., Papp N. (2016), Phytochemical overview and medicinal importance of Coffea species from the past until now, Asian Pacific Journal of
Tropical Medicine, 9(12), 1127-1135.
[3] Ramalakshmi K. and Raghavan B. (1999), Caffeine in coffee: its removal - Why an how?, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 39(5), 441-456. [4] Wei F. and Tanokura M. ( 2015), Chapter 17: Organic compounds in green coffee
beans, Coffee in Health and Disease Prevention, Elsevier Inc., 149-162.
[5] Jaiswal R. (2010), Profiling and characterization of the chlorogenic acids in green robusta coffee beans by LC-MSn : Identification of seven new classes of compounds, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58(15), 8722–8737. [6] Oestreich-Janzen S. (2010), Chemistry of coffee, Journal of Agricultural and
Food Chemistry, 53, 1085-1117.
[7] Arnold U., Ludwig E., Kuhn R., Moschwitzer U. (1994), Analysis of free amino acids in green coffee, Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung,
1(69), 22-25.
[8] Murkovic M. and Derler K. (2006), Analysis of amino acids and carbohydrates in green coffee, J.Biochem. Biophys. Methods, 1-2(69), 25-32.
[9] Teutsch I. A. (2004), Einfluss der Rohkaffeeverarbeitung auf Aromastoffveränderungen in gerösteten Kaffeebohnen sowie im Kaffeebetränk, PhD Thesis, Technical University Munich, Germany, Department of Chemistry. [10] Hu G. L., Wang X., Zhang L. and Qiu M. H. (2019), The sources and mechanisms of bioactive ingredients in coffee, Food & Function, 10, 3113-3126. [11] Moeenfard M. and Alves A. (2020), New trends in coffee diterpenes research
34
[12] Kölling-Speer I, Kurzrock T, Speer K (2001), Contents of diterpenes in green coffees assigned for the European market, 19th International Colloquium on the
Chemistry of Coffee, ASIC, Paris.
[13] N. T. Tiến và P. T. H. Minh (2009), "Về thành phần hóa học của lá cà phê chè,
Coffea arabica, Tạp chí Hóa học, 47(6B), 213-216.
[14] Redgwell R.J., Curti D., Rogers R., Nicolas P., Fischer M. (2003), Changes to the galactose/mannose ratio in galactomannans during coffee bean (Coffea
arabica L.) development, implications for in vivo modification of galactomannan
synthesis, Planta, 217(2), 316-326.
[15] Gotoda N., Iwai K., Furuya K., Ueda T., Fukunaga T., Kimura R., Takagi M. (2006), Arabinogalactan isolated from coffee seeds indicates immunomodulating
properties, ASIC 21st International Conference on Coffee Science, Montpellier, France.
[16] Ferré S. (2008), An update on the mechanisms of the psychostimulant effects of caffeine, Journal of Neurochemistry, 105(4), 1067-1079.
[17] Messina G., Zannella C., Monda V., Dato A., Liccardo D., De Blasio S., Valenzano A., Moscatelli F., Messina A., Cibelli G. and Monda M (2015), The Beneficial Effects of Coffee in Human Nutrition, Biology and Medicine, 7(4), 1- 5.
[18] Wood A.D., Aspden R, Reid D., Macdonald H.M. (2012), Associations between dietary patterns, tea & coffee drinking and osteoarthritis, Osteoarthritis
Cartilage, 20, 192–193.
[19] Ascherio A. , Zhang S. M., Hernán M. A., Kawachi I., Colditz G. A., Speizer F. E., Willett W. C. (2001), Prospective study of caffeine consumption and risk of Parkinson's disease in men and women, Ann Neurol, 50, 56-63.
[20] Nkondjock A. (2009), Coffee consumption and risk of cancer: an overview,
35
[21] Holick C.N., Smith S. G. , Giovannucci E., Michaud D.S.(2010), Coffee, tea, caffeine intake, and risk of adult glioma in three prospective cohort studies,
Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention, 19, 39–47.
[22] Karita M., Tsuchiya H., Yamamoto N., Shirai T., Hayashi K., Nishida H.(2013), Caffeine-potentiated chemotherapy for clear cell sarcoma: a report of five cases, International Journal of Clinical Oncology, 18, 33-37.
[23] Miwa S., Kitamura S., Shirai T., Hayashi K., Nishida H., Takeuchi K., Nojima T., Tsuchiya H.(2010), Desmoplastic small round cell tumour successfully treated with caffeine-assisted chemotherapy: a case report and review of the literature, Anticancer Research, 30, 3769–3774.
[24] Djaldet M., Bergman M., Salman H., Bessler H. (2015), On the Linkage between Caffeine, Cytokine Secretion, and Cancer, Coffee in Health and Disease Prevention, Academic Press, 645–653.
[25] Arauz P. and Muriel J.(2010), Coffee and liver diseases, Fitoterapia, 81(5),
297–305.
[26] Odegaard A.O. et al(2008), Coffee, tea, and incident type 2 diabetes: the Singapore Chinese Health Study, The American Journal of Clinical Nutrition,
88(4), 979–985.
[27] Huxley R.(2009), Coffee, Decaffeinated Coffee, and Tea Consumption in Relation to Incident Type 2: Diabetes Mellitus, Arch Intern Med, 169(22), 2053- 2063.
[28] Kamble H. and Bodhankar S.( 2013), Trigonelline and sitagliptin attenuates nicotinamide-streptozotocin induced diabetic nephropathy in Wistar rats,
International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 5(4), 583-589.
[29] Yoshinari O. et al(2019), Anti-diabetic effects of pumpkin and its components, trigonelline and nicotinic acid, on Goto-Kakizaki rats, Biosci Biotechnol Biochem, 73, 1033–1041.
36
Components: Assessment of Methods that Define Mechanisms of Action,
Molecules, 19(11), 19180-19208.
[31] Madhava Naidu M. et al(2008), Studies on extraction and antioxidant potential of green coffee," Food Chemistry, 107(1), 377–384.
[32] Acheson K. J.( 2004), Metabolic effects of caffeine in humans: lipid oxidation or futile cycling?, The American Journal of Clinical Nutrition, 79(1), 40-46. [33] Fidalgo T. et al(2009), CHAPTER 11. Effect of Coffee on Oral Bacteria
Involved in Dental Caries and Periodontal Disease: Consumption and Health Implications, Coffee: Consumption and Health Implications, 255 - 264.
[34] Apostolidis E, Kwon Y-I, Shetty K. (2007), Inhibitory potential of herb, fruit, and fungal-enriched cheese against key enzymes linked to type 2 diabetes and hypertension, Innov Food Sci Emerg Technol, 8(1), 46–54.
[35] Mahato SB, Kundu AP. (1994), 13C NMR Spectra of pentacyclic triterpenoids—a compilation and some salient features, Phytochemistry, 37(6),
1517–1575.
[36] Calderón AI, Simithy J, Quaggio G, Espinosa A, López-Pérez JL, Gupta MP. (2009), Triterpenes from Warszewiczia coccinea (Rubiaceae) as Inhibitors of
Acetylcholinesterase, Nat Prod Commun, 4(10), 1323–1326.
[37] Elujoba AA, Fell AF, Linley PA, Maitland DJ. (1990), Triterpenoid saponins from fruit of Lagenaria breviflora, Phytochemistry, 29(10),3281–3285.
37
Phụ lục 1a: PHỔ HR-ESI-MS CỦA HN1
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57