2.4.1. Dụng cụ
Kính hiển vi, kính soi nổi, lam kính, lamen, dao giải phẫu, kéo, panh kẹp, hộp lồng, kim giải phẫu, cốc thủy tinh, đèn cồn, pipet hút, khay đựng mẫu, cân, thƣớc đo,… Nƣớc muối sinh lý, nƣớc biển sạch, nƣớc cất, cồn, formol, hematoxylin, nhựa canada, acid acetic, lactophenol, ….
2.4.2. Xử lý mẫu
Trƣớc khi kiểm tra và thu thập ký sinh trùng, cần ghi đầy đủ các thông tin: ngày, tháng, năm, địa điểm thu mẫu.
Mẫu ghẹ nghiên cứu
Làm tiêu bản Thu thập, cố định và bảo quản mẫu
Soi tƣơi Lấy mẫu KST Đo, đếm, vẽ, mô tả, chụp ảnh KST KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Xác định TLCN và CĐCN Phân loại KST
Kiểm tra các cơ quan bên ngoài (mai, càng, chân, antel,…)
Kiểm tra các cơ quan bên trong (mang, dạ dày, tim,…) Xác định khối lƣợng và CW
Xác định khối lƣợng ghẹ bằng cân có độ chính xác 0,1 gram; đo chiều rộng mai bằng thƣớc kẹp có độ chính xác 1mm.
2.4.3. Các bƣớc tiến hành
Đặt ghẹ lên đĩa Petri có chứa nƣớc biển. Xem xét cẩn thận ký sinh trùng và sinh vật cộng sinh ở bên ngoài cơ thể bằng mắt thƣờng và dƣới kính giải phẩu. Khi phát hiện thấy động vật ký sinh (ĐVKS) thì tiến hành tách chúng ra dƣới kính giải phẩu, đặt lên lam rồi quan sát ở các độ phóng đại lớn hơn để thấy rõ hơn các bộ phận của ĐVKS. Cuối cùng xác định cƣờng độ nhiễm, chụp hình, vẽ, đo và cố định mẫu.
Dùng xilanh lấy máu của ghẹ (ở gốc chân bò thứ năm) dàn đều lên lam kính. Đem quan sát dƣới kính hiển vi với các độ phóng đại khác nhau (10x4, 10x10, 10x40, 10x100 lần) để kiểm tra phát hiện ký sinh trùng. Ở máu ghẹ có thể bắt gặp một số
giống ĐVKS: Ameson, Hematodinium, levinseniella. Nếu phát hiện ĐVKS thì thu
mẫu, làm sạch mẫu, chụp hình, đo, vẽ,… để tiến hành phân loại.
Tiếp theo dùng kéo cắt yếm ghẹ cho vào hộp lồng có chứa nƣớc biển. Tách phần phụ bụng và khối trứng đối với những con ghẹ ôm trứng, và kiểm tra dƣới kính sôi nổi. Khi phát hiện ĐVKS dùng kim giải phẩu tách chúng ra, dùng pipet hút ĐVKS cho vào lam kính xem tƣơi dƣới kính hiển vi; tiến hành chụp hình, vẽ, đo kích thƣớc và cố định mẫu.
Cắt các phần của miệng ghẹ cho vào hộp lồng chứa nƣớc biển và quan sát dƣới kính sôi nổi. Khi phát hiện ĐVKS thì tách chúng ra, cho vào lam và quan sát các bộ phận của chúng dƣới kính hiển vi. Chụp hình, vẽ, đo kích thƣớc... để tìm khóa phân loại ĐVKS.
Tháo mai, cắt mang cho vào các hộp lồng chứa nƣớc biển và kiểm tra dƣới kính sôi nổi. Lấy những mảnh nhỏ của mang đặt trên lam và kiểm tra dƣới kính hiển vi. Khi phát hiện có ĐVKS, cắt các tơ mang có trùng cho vào hộp lồng khác, dùng chui nhọn tách trùng đƣa lên lam kính, đậy lamen lên và quan sát dƣới kính hiển vi với các độ phóng đại khác nhau.
Dùng gắp tách tim cho vào lam, ép tim ở giữa hai lam và kiểm tra dƣới kính hiển vi.
Tách dạ dày → cắt chúng ra từ thực quản → đặt trên đĩa petri có chứa nƣớc biển → kiểm tra dƣới kính lúp và kính hiển vi.
Ép tuyến sinh dục ở giữa hai miếng lam và kiểm tra dƣới kính hiển vi.
Cắt ruột theo chiều dọc bằng kéo nhỏ, ép nhẹ giữa hai lam kính. Đặt gan tụy lên đĩa petri lớn và ép phẳng bằng đĩa petri nhỏ lên trên. Lấy mô cơ từ càng ra và ép lại giữa hai tấm kính.
Tuyến sinh dục, ruột, gan tụy và mô cơ đƣợc kiểm tra trƣớc tiên dƣới kính sôi
nổi và kính hiển vi. Khi phát hiện trùng thì tách chúng ra cho vào nƣớc muối sinh lý. Tiếp theo cho trùng lên lam kính, đậy lamen và quan sát dƣới kính hiển vi với các độ phóng đại từ nhỏ đến lớn. Có thể phân loại trùng qua mẫu tƣơi hoặc nhuộm trùng để quan sát các bộ phận bên trong dễ dàng hơn.
2.4.4. Chuẩn bị và cố định
Nhóm trùng lông (Ciliate) đƣợc quan sát trong môi trƣờng sống bằng kính hiển vi và sau đó cố định trong dung dịch formaldehyde 4%.
Giun tròn (Nematodes) đƣợc di chuyển ra từ pipet và gắn kết (mẫu đƣợc đặt lên lam kính, thêm một ít Vaseline vào 4 góc của lamen, ép nhẹ mặt lamen có Vaseline lên lam kính nơi có mẫu vật). Đầu tiên, giun tròn đƣợc xử lý với dung dịch Berland (Glacial acetic acid – GAA) hoặc dung dịch Berland trộn với thuốc nhuộm đỏ DYLON của Mexico (0,1 g/lít) để ngăn chúng cuộn lại. Sau đó, Lactophenol sẽ đƣợc thêm vào làm cho mẫu vật trong suốt để có thể nhìn cấu trúc bên trong. Sau đó đƣa lên kính hiển vi để quan sát và vẽ hình dạng cơ thể cùng các cơ quan bên trong [12].
Giun nhiều tơ, giun ít tơ và copedods đƣợc cố định trong Lactophenol. Động vật thân mềm 2 mảnh vỏ và hàu đƣợc cố định trong Formaldehyde 4% (Berland, 2005) [12].
Các sinh vật đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi với ống kính bản vẽ kèm theo (Camera Lucida) để vẽ các mẫu vật, hình ảnh đƣợc chụp với máy ảnh Sony Cyber – shot.
Nhuộm và làm tiêu bản:
+/ Động vật đơn bào: Lấy lam có trùng xếp một lƣợt vào hộp lồng lớn,
hƣớng mặt có trùng lên trên, nhỏ AgNO3 2 % đều khắp bề mặt lam. Để trong bong tối
10 phút. Sau đó rửa nƣớc sạch nhiều lần và ngâm lam trong nƣớc ngập sâu khoảng 1,0 - 1,5 cm, phơi dƣới ánh nắng mặt trời trong thời gian 30 - 60 phút. Rửa nƣớc cất nhiều lần, để khô. Kiểm tra trên kính hiển vi, chọn tiêu bản đẹp, gắn tiêu bản bằng Canada balsam. Dán etyket, ghi nhãn đầy đủ.
+/ Sán lá đơn chủ: Tách sán cẩn thận ra khỏi nơi ký sinh, rửa sạch bằng nƣớc muối sinh lý, đƣa lên lam kính, nhỏ một giọt Glacial acetic acid lên cơ thể sán, làm khô, sau đó gắn tiêu bản bằng Canada balsam. Dán etyket, ghi nhãn đầy đủ.
+/ Sán lá song chủ: Đặt trùng lên lam kính sạch, nhỏ vài giọt acid acetic đậm đặc lên trùng và để trong thời gian 5 - 10 phút (tùy theo kích thƣớc trùng). Hoặc
dùng cồn ở các nồng độ lần lƣợt 50o
, 70o, 90o, 96o, mỗi nồng độ cồn để khoảng 5 - 10
phút. Sau đó, dùng giấy thấm lau sạch những phần xung quanh. Nhỏ 1 giọt carmin lên trùng và để trong khoảng thời gian 5 - 10 phút. Trong quá trình nhuộm thƣờng xuyên quan sát dƣới kính hiển vi, nếu thấy trùng bắt màu vừa đạt thì dùng nƣớc cất rửa sạch
mẫu. Gắn tiêu bản bằng nhựa Canada balsam. Dán etyket, ghi nhãn đầy đủ.
2.4.5. Xử lý số liệu
Mức độ cảm nhiễm KST trên ghẹ đƣợc đánh giá theo Margolis & ctv (1982) [51] và Albert & ctv (1997) [10].
Tỷ lệ cảm nhiễm (TLCN).
Cƣờng độ cảm nhiễm (CĐCN)
KST có kích thƣớc rất nhỏ: Trùng đơn bào, tính cƣờng độ nhiễm bằng số lƣợng KST đếm trên thị trƣờng kính hiển vi.
Đối với KST có kích thƣớc lớn nhƣ giun tròn, giáp xác, đếm toàn bộ số KST trên ghẹ:
Số liệu đƣợc phân tích và xử lý bằng phƣơng pháp thống kê sinh học dùng phần mềm Microsoft Excel. Các số liệu đƣợc thể hiện dƣới dạng trung bình ± SD (độ lệch chuẩn)
So sánh mức độ cảm nhiễm bằng phƣơng pháp Chi – square. So sánh cƣờng độ cảm nhiễm bằng Mann Whitney U test. Các kết quả so sánh với mức ý nghĩa α = 0,05.
CĐCNTB (Trùng/TTK) = Tổng số trùng trên các TTK kiểm tra
Số TTK kiểm tra có KST
CĐCNTB (Trùng/ghẹ) = Tổng số trùng trên các con ghẹ kiểm tra
Số ghẹ kiểm tra có KST
TLCN (%) = Số ghẹ nhiễm KST
Số ghẹ kiểm tra x 100
%
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thành phần loài, tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm KST trên ghẹ xanh (Portunus
pelagicus).
3.1.1. Thành phần giống loài ký sinh trên ghẹ xanh.
Kết quả nghiên cứu ký sinh trùng từ 159 con ghẹ xanh (Portunus pelagicus) đã
tìm thấy 7 loài thuộc 5 họ và 1 loài giun dẹp chƣa xác định (Bảng 3.1). Trong đó, 2
loài thuộc ngành trùng lông (Ciliophora), 1 loài thuộc ngành động vật thủy sinh nhỏ
(Entoprocta), 1 loài thuộc ngành giun (Nemertea) và 3 loài thuộc ngành động vật chân khớp (Arthropoda). Shields (1992) [71] đã nghiên cứu ký sinh trùng và sinh vật cộng
sinh trên ghẹ xanh (Portunus pelagicus) ở Australia; kết quả tìm đƣợc 6 loài protozoa,
5 loài giun và 4 loài giáp xác.
Stt Ngành Lớp Bộ Họ Giống Loài
1 Ciliophora Doflien, 1901
Oligohymenophorea Puytoracetae, 1974
Peritrichida Stein, 1859 Epistylididae Kahl, 1935 Epistylis Ehrenberg, 1830 Epistylis sp. 2 Ciliophora Doflien, 1901 Oligohymenophorea Puytoracetae, 1974
Peritrichida Stein, 1859 Epistylididae Kahl, 1935 Apiosoma Blanchard, 1885 Apiosoma sp. 3 Entoprocta Nitsche, 1870
Không ghi nhận Không ghi nhận Loxomatidae Hinck, 1880
Loxosomella
Keferstein, 1862
Loxosomella sp.
4 Nemertea Brusca & Gary, 1990
Enola Shultze, 1851 Monostilifera Brinkmann, 1917 Carcinonemertidae Coe, 1902. Carcinonemertes Coe, 1902. Carcinonemertes sp.
5 Không xác định Không xác định Turbellaria
6 Arthropoda Siebold & Stannius,1845 Maxillopoda Dahl, 1956 Siphonostomatoida Thorell, 1859 Nicothoidae Dana, 1852 Choniosphera Connolly, 1929 Choniosphera indica Gnanamuthu, 1954. 7 Arthropoda Siebold & Stannius,1845 Maxillopoda Dahl, 1956 Lepadiformes
Buckeridge & Newman, 2006 Poecilasmatidae Annandale, 1909 Octolasmis Gray, 1825 Octolasmis warwickii, Gray, 1825. 8 Arthropoda Siebold & Stannius,1845 Maxillopoda Dahl, 1956 Lepadiformes
Buckeridge & Newman, 2006 Poecilasmatidae Annandale, 1909 Octolasmis Gray, 1825 Octolasmis sp.
Bảng 3.1. Thành phần ký sinh trùng trên ghẹ xanh
3.1.2. Một số đặc điểm phân loại các loài ký sinh trùng
3.1.2.1. Loài Epistylis sp.
Cơ quan ký sinh: miệng.
TLCN: 16,35 %; CĐCN không ghi nhận
Mô tả hình thái:
Cơ thể chia làm 2 phần: phần thân và phần cuống. Phần thân có dạng hình chuông hoặc hình trứng với các bào tử động, không đối xứng. Phần cuống không phân
nhánh và không co lại. Epistylis sp. là những cá thể đơn gắn vào các nhánh của chân
hàm. Kích thƣớc của Epistylis sp. là 57 – 80 µm chiều dài thân, 24 – 65 µm chiều dài
cuống. Chiều rộng lớn nhất ở khoảng một phần hai thân. Vòm miệng ở trên thân, phía dƣới là một không bào co bóp luôn hoạt động. Nhân lớn có dạng hình móng ngựa nằm ở khoảng giữa thân.
Hình 3.1: Hình dạng cơ thể Epistylis sp.
1: vòm miệng, 2: không bào co bóp, 3: nhân lớn, 4: không bào tiêu hóa
Theo kết quả nghiên cứu của Hongwei và Overstreet (2006) [40] đã tìm thấy 2
loài Epistylis clampi và Epistylis callinectes trên các nhánh chân hàm, tơ cứng của
lƣợc mang và mang của cua xanh (Callinectes sapidus) ở Vịnh Mexico. Cơ thể
Epistylis callinectes ngắn, hình trứng thon dài, đối xứng và cuống phân đôi; với chiều dài thân và cuống tƣơng ứng là 35 – 64 (µm) và 21 – 30 (µm). Nhân lớn hình móng
ngựa nằm ở khoảng một phần ba thân. Epistylis clampi có chiều dài thân và cuống
tƣơng ứng là 40 – 57 (µm) và 18 – 33 (µm). Cơ thể Epistylis clampi dài hơn loài E.
callinectes, không đối xứng, và cuống phân đôi. Hình dạng cơ thể giống nhƣ chiếc bình, thon dài. Nhân lớn hình móng ngựa ở vị trí cao hơn phân nữa thân. Kích thƣớc
của hai loài trên nhỏ hơn loài Epistylis sp. đã đƣợc tìm thấy trong nghiên cứu này.
Hình dạng cơ thể cũng nhƣ vị trí nhân lớn của Epistylis sp. không giống với loài
Epistylis clampi và E. callinectes.
Theo mô tả về giống Epistylis của Jiri và Iva (1992) thì hình dạng cơ thể của
loài Epistylis sp. giống nhƣ loài E. apiosomae và E. transvaalensis, nhƣng cuống của
chúng không phân nhánh nhƣ các loài Epistylis khác [30]. Giống Epistylis thƣờng ký
sinh ngoài trên động vật không xƣơng sống, trên bề mặt mang của cá nƣớc ngọt, và trứng và ấu trùng cua xanh [30,48].
3.1.2.2. Loài Apiosoma sp.
Cơ quan ký sinh: Chân hàm.
TLCN: 3,77 %; CĐCN không ghi nhận.
Mô tả hình thái:
Cơ thể thon dài và phần nào giống nhƣ một chiếc cốc. Chiều dài toàn thân khoảng 57,60 ± 0,24 µm. Cơ thể thon nhọn dần từ đĩa của vòm miệng đến thân.
Apiosoma sp., với dãy lông mao trên vòm miệng, bên dƣới là một không bào co bóp nằm trực tiếp dƣới vòm miệng và xung quanh cơ quan hình phễu. Nhân lớn nằm ở phần sau của cơ thể, nó có dạng nhƣ hình trụ và thon gọn về phía dƣới.
Hình 3.2 : Hình dạng cơ thể Apiosoma sp.
1: lông mao, 2: đĩa miệng, 3: không bào co bóp, 4: cơ quan hình phễu, 5: nhân nhỏ, 6: nhân lớn.
Apiosoma là giống xuất hiện khá nhiều trên các loài cá nƣớc ngọt [30] và đã có ghi nhận loài này trên cá mú, cá chẽm ở Việt Nam [2,5]. Đây có thể là ghi nhận đầu tiên về sự ký sinh của loài này trên ghẹ xanh.
3.1.2.3. Loài Loxosomella sp.
Cơ quan ký sinh: mang.
TLCN: 5,08 %, CĐCN: 28,86 (trùng/ghẹ).
Mô tả hình thái:
Cơ thể Loxosomella sp. chia làm hai phần: phần cuống và phần đài. Chiều dài cơ
thể khoảng 576,7 ± 17,2 µm, với tỷ lệ cuống/đài: 1/1+
. Đài có chiều dài lớn hơn chiều rộng, dạng nhƣ hình oval, với 6 xúc tu. Các xúc tu mở rộng để tìm thức ăn, khi gặp tác động thì các xúc tu co lại trên vòm miệng. Dạ dày giống nhƣ dạng quả lê úp ngƣợc. Ở những con trƣởng thành thƣờng có một chồi mọc ra từ phần sau của đài, đây có thể là
cá thể con của Loxosomella sp.
Hình 3.3: Loxosomella sp.
a: phần đài, b: phần cuống. 1: xúc tu, 2: dạ dày, 3: chồi.
Dorothy và John (1965) đã tìm thấy hai loài Loxosomella macginiteorum và
Loxosomella prenanti trên loài tôm tít Pseudosquilla bigelowi [21]. Nghiên cứu này là
ghi nhận đầu tiên về giống Loxosomella trên giống Portunus.
3.1.2.4.Loài Carcinonemertes sp.
Cơ quan ký sinh: mang, yếm ghẹ đực, trứng ghẹ cái.
TLCN: Mang của ghẹ cái và ghẹ đực (72,96%); Yếm ghẹ đực (61,25%); Trứng ghẹ cái (50,00%)
CĐCN: Mang của ghẹ cái và ghẹ đực (47,76 trùng/ghẹ); Yếm ghẹ đực (31,06 trùng/ghẹ); Trứng ghẹ cái (22,39 trùng/ghẹ).
Mô tả hình thái:
Loài giun này xuất hiện khá nhiều trên cơ thể ghẹ. Những cá thể nhỏ chƣa trƣởng thành thƣờng thấy trên yếm của ghẹ đực và phần cuối của mang ghẹ, với kích thƣớc khoảng 0,70 ± 0,06 mm chiều dài. Những cá thể lớn hơn thƣờng xuất hiện ở phần giữa và đầu của mang ghẹ, cơ thể gập lại trong lớp màng nhầy. Các cá thể trƣởng thành nằm trên khối trứng dƣới yếm ghẹ cái.
Hình 3.4: Carcinonemertes sp.
A: Hình dạng cơ thể; hình giun trên mang và trên trứng ghẹ. B, C, D: Hình vẽ phần đầu, phần thân và mấu thực quản (Stylet).
1: xoang miệng; 2: mắt đơn; 3: vòng thần kinh; 4: khoang trƣớc; 5: mấu thực quản (stylet); 6: khoang giữa; 7: thực quản; 8: khoang sau; 9: dây thần kinh; 10: ruột.
B
C
D A
Cơ thể nhỏ, thon dài, hình chỉ, hình trụ tròn; chiều dài con trƣởng thành khoảng 1,19 ± 0,23 cm, khi duỗi ra có thể đạt 5 – 7 cm. Cơ thể không ngoằn ngoèo hoặc nhiều cuộn nhƣng hình dạng thƣờng khoanh lại để phần trƣớc của cơ thể nằm tƣơng đƣơng và tiếp xúc với phần sau (giun ở mang). Cơ thể màu gạch nhạt. Đầu không tách biệt với phần bên của rảnh, không có ranh giới phân chia với thân. Hai mắt đơn, một phần của mắt không đều về đƣờng nét; đôi lúc hình lƣỡi liềm, nằm hai bên xoang miệng. Thực quản ngắn và riêng biệt, mở rộng vào về phía ruột, nằm ngay sau vòng thần kinh. Ruột rộng với các khoang bên ngắn, phần sau của cơ thể ít phát triển. Xoang miệng kém phát triển, không có thành tế bào cơ, chỉ đơn thuần là một màng mỏng kèm theo một ống nhỏ. Khu vực stylet có thể rút lại nhƣng ít nhất phải nằm phía sau vòng thần kinh; do đó khoang trƣớc rất ngắn. Chiều dài của stylet khoảng 34 – 42 µm. Với chiều
dài cơ thể khoảng 1,19 cm thì Carcinonemertes sp. ngắn hơn loài Carcinonemertes