CHƯƠNG 2 : THỰC NGHIỆM
2.3 Nội dung nghiên cứu
2.3.1.2 Trích ly bằng dung mơi hexan
Tinh dầu được trích ly bằng hexan được tóm tắt theo sơ đồ sau : Vỏ cam Sơ chế Xay Cân Làm khan Tách tinh dầu Chưng cất
Tinh dầu thô Nước Na2SO4 Tinh dầu Vỏ lụa Tinh chế Phần nước
21
Hình 2.3 : Sơ đồ trích tinh dầu trong hexan
Thuyết minh sơ đồ: Vỏ cam được làm sạch và xay (với dung môi hexan) tương tự chưng cất lôi cuốn hơi nước. Sau đó cho hỗn hộp vào beaker 1000ml thêm vào dung môi hexan với tỷ lệ phần vỏ cam và hexan là 1:1 (g/ml). Trích ly trong 12 giờ, lọc lấy phần dịch lọc và loại bỏ phần vỏ cam rắn. Phần dung dịch sẽ được chiết trong phễu chiết và thu phần dung dịch phía trên. Phần dung dịch này được tinh chế tạo tinh dầu [19, 21].
2.3.2 Tối ưu quy trình trích ly tinh dầu cam bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước
2.3.2.1 Khảo sát dạng nguyên liệu
Vỏ cam Sơ chế Xay Cân Chiết Lọc Ngâm hexan Cô quay Hexan Cồn Tinh dầu Vỏ lụa Cồn Phần rắn
22
Nguyên liệu được đồng nhất: nguồn gốc, cách xử lý và cố định các yếu tố trong quá trình chưng cất. Khảo sát sự ảnh hưởng của dạng nguyên liệu theo bảng sau :
Bảng 2.1 Khảo sát dạng nguyên liệu STT Mẫu Dạng nguyên STT Mẫu Dạng nguyên liệu Yếu tố cố định Bố trí thí nghiệm Chỉ tiêu đánh giá 1 TN1-1 Xay Thời gian chưng : 2.5h
Tỷ lệ dung môi : 1:3 Nhiệt độ : 130oC Khối lượng vỏ : 80g 3 Thể tích tinh dầu 2 TN1-2 Không xay 3 3 TN1-3 Dạng tươi 3 4 TN1-4 Dạng khô 9 5 TN1-5 Dạng đông 6
Ngoài các yếu tố khảo sát trên ở dạng ngun liệu khơ và tươi ta cịn khảo sát sự mất mát khối lượng của vỏ cam trong quá trình chế biến. Riêng đối với mẫu khơ, ta cịn khảo sát độ ẩm của mẫu theo TCVN8900 – 2:2012.
2.3.2.2 Khảo sát tỷ lệ dung môi
Vỏ cam cũng được đồng nhất giống như khảo sát ảnh hưởng của các dạng nguyên liệu [22]. Tiến hành chưng cất cố định các yếu tố và thay đổi tỷ lệ dung môi theo bảng sau:
Bảng 2.2 Khảo sát tỷ lệ nước và tinh dầu STT Mẫu Tỷ lệ nguyên liệu : nước STT Mẫu Tỷ lệ nguyên liệu : nước
( g/ml) Yếu tố cố định Số thí nghiệm Chỉ tiêu đánh giá 1 TN2-1 100:100 (1:1) Vỏ đông : 100 g Thời gian: 2.5h Nhiệt độ: 130oC Xay : 20 giây 3 Thể tích tinh dầu 2 TN2-2 100:150 (2:3) 3 3 TN2-3 100:200 (1:2) 3 4 TN2-4 100:300 (1:3) 3
2.2.3.3 Khảo sát thời gian chưng cất
Nguyên liệu chưng cất tiếp tục được đồng nhất giống như hai khảo sát trên. Sau đó được tiến hành chưng cất với các thời gian khác nhau để xác định được thời gian tối ưu cho quá trình chưng cất. Thời gian chưng cất sẽ quyết định chất lượng và giá thành của tinh dầu do quyết định lượng năng lượng tiêu tốn [22, 23]. Thời gian chưng cất được khảo sát theo bảng sau:
23
Bảng 2.3 Khảo sát thời gian chưng cất STT Mẫu Thời gian STT Mẫu Thời gian
chưng cất (h) Yếu tố cố định Số thí nghiệm
Tiêu chuẩn đánh giá 1 TN3-1 1.5 Tỷ lệ dung môi:1:3 Vỏ đông: 100g Nhiệt độ : 130oC Xay : 20 giây 3 Thể tích tinh dầu 2 TN3-2 2 3 3 TN3-3 2.5 3 4 TN3-4 3 3 2.3.3 Phân tích các tích chất vật lý
Mõi loại tinh dầu được tiêu thụ trên thì trường đều phải thỏa mãn các điều kiện về các tính chất vật lý. Các tính chất này được quy định theo từng quốc gia hoặc từng khu vực. Ở Việt Nam, các tính chất vật lý của tinh dầu cam được quy định trong TCVN 11424:2016 về tinh dầu ngọt. Dựa vào các tiêu chuẩn này tinh dầu cam sành được khảo sát các tiêu chuẩn trong bảng sau :
Bảng 2.4 Khảo sát tính chất vật lý
STT Chỉ tiêu đánh giá Số thí nghiệm Tiêu chuẩn đánh giá 1 Màu 3 TCVN11424:2016 2 Mùi 3 3 Vị 3 4 Tỷ trọng 3 5 Chỉ số khúc xạ 3 6 Góc quay cực 3
2.3.4 Định hương tinh dầu bằng polymer
2.3.4.1 Khảo sát khả năng tạo ổn định nhủ
Tinh dầu sau khi khảo sát tính chất vật lý và thành phần hóa học cho kết quả phù hợp. Vi bao tinh dầu này bằng các polymer: chitosan, CMC, pectin và hỗn hợp với tỷ lệ (1:1). Để vi bao tốt tinh dầu polymer cần ổn định hệ nhũ tương (tinh dầu trong nước) tốt ngăn cản sự phân tách pha ảnh hưởng sự đồng nhất của hệ.
Cách tạo nhũ: Chất nhũ hóa được hịa tan với nước với tỷ cố định là 3% và được chuẩn bị trước một ngày sau khi tạo nhũ. Mẫu chất nhủ hóa được đun nóng đến nhiệt độ 60oC và được khuấy ở tốc độ 1200 (v/phút) trong 5 phút. Tiếp đó, glycerol được cho vào với tỷ lệ 50% so với khối lượng chất nhủ hóa và khuấy với tốc độ 1200 (v/phút)
24
trong 5 phút. Hỗn hợp nhũ tương được chia đều vào những ống nghiệm 10ml có vạch chia. Xác định độ ổn định nhủ của của các chất trong bảng sau:
Bảng 2.5 Khảo sát khả năng ổn định nhủ STT Mẫu Thành phần Số thí STT Mẫu Thành phần Số thí nghiệm Chỉ tiêu đánh giá 1 TN4-1 CMC 3 Khả năng ổn định 2 TN4-2 CMC:C (1:1) 3 3 TN4-3 C 3 4 TN4-4 P 3 5 TN4-5 P:CMC(1:1) 3 6 TN4-6 C:P( (1:1) 3
2.3.4.2 Khảo sát khả năng vi bảo
Sau giai đoạn đánh giá khả năng tạo nhũ, polymer có đặc tính hóa lý và độ ổn định phù hợp được chọn. Polymer này tiếp tục được khảo sát khả năng vi bao với các tỷ lệ 4- 6% để vi bao 5% tinh dầu. Quy trình tạo nhũ tương giống như khảo sát khả năng ổn định nhũ. Sau đó, nghiên cứu tiến hành các đánh giá theo bảng sau:
Bảng 2.6 Khảo sát khả năng vi bao
STT Mẫu Số thí nghiệm Chỉ tiêu đánh giá 1 TN5-1 3 Khả năng vi bao 2 TN5-2 3 3 TN5-3 3
2.3.4.3 Khảo sát hiệu suất sấy.
Phân tích hiệu quả sấy được thực hiện để đo lượng tinh dầu còn lại trong các viên nang siêu nhỏ. Phương pháp này dựa trên sự giải phóng tinh dầu vi bao và không vi bao bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước sản phẩm. Hiệu suất sấy giúp nhận biết sự mất mát tinh dầu trong quá trình định hương. Sự mất mất tinh dầu này là do sự gia nhiệt trong quá trình tạo nhủ. Từ đó, nghiên cứu sẽ rút ra tỷ lệ tinh dầu phù hợp với một lượng chất nhủ hóa nhất định.
2.3.5 Ứng tạo sản phẩm gel tinh dầu cho ôtô.
Sau khi nghiên cứu các công thức trên thị trường và cải tiến phù hợp với sản phẩm tinh dầu tạo ra thu được công thức [24, 25]. Công thức được tạo với khối lượng sản phẩm tạo ra là 100g :
25
Bảng 2.7 Công thức sản phẩm gel tinh dầu
STT Chất Hàm lượng (%) Chỉ tiêu đánh giá
1 Chất tạo nhủ 3
Đánh giá kích thước hạt và thời
gian luu hương.
2 Tinh dầu 5 3 Agar 1 4 Glycerol 0.1 5 Cồn 10 6 Nước - 7 Phụ gia -
Cách tiến hành: Chất tạo nhũ được hòa tan trong nước với hàm lượng 3% khuấy ở tốc độ 1200 v/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 50oC. Hỗn hợp được đặt ở nhiệt độ phòng trong 24h để tăng cường khả năng hydrat của chất tạo nhũ. Sau đó dung dịch được nung nóng ở 60oC và khuấy tốc độ 1200v/phút trong 5 phút. Tiếp đó, cho 5% tinh dầu cam vào hỗn hợp khuấy ở tốc độ trên trong 10 phút. Trong thời gian đó, ta chuẩn bị dung dịch agar với nồng độ 1%. Cho dung dịch agar vào hỗn hợp rồi tiếp tục khuấy trong 10 phút. Cuối cùng thêm vào hỗn hợp glycerol với tỷ lệ 0.1% giúp tăng cường khả năng nhủ hóa. Sau đó mẫu được rót vào các vật chứa với khối lượng 10g và đề nguội đến nhiệt độ phòng. Sản phẩm tạo ra được đánh giá về kích thước hạt bằng kính hiển vi và thời gian lưu hương bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước.
2.4 Phương pháp phân tích
2.4.1 Khảo sát độ ẩm
Độ ẩm của mẫu được khảo sát theo TCVN 8900 – 2:2012 theo phương pháp sau: Cách tiến hành: Cân từ 1-2 gam mẫu, chính xác đến 0,1 mg. Cân trước đĩa petri đã được sấy trong 30 phút. Sau đó, chuyển mẫu vào đĩa petri, chú ý dàn đều để bề dày lớp mẫu khoảng 5 mm và không quá 10 mm. Đặt đĩa có chứa mẫu vào tủ sấy, sấy đến khối lượng không đổi ở 105oC. Khi lấy mẫu ra, chuyển vào bình hút ẩm ngay để làm nguội mẫu đến nhiệt độ phịng. Sau đó đem đi cân mẫu. Độ ẩm của mẫu thử biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo cơng thức sau:
X = W1-W2
W1 × 100
26
W1 là khối lượng của phần mẫu thử trước khi sấy, tính bằng gam (g). W2 là khối lượng của phần mẫu thử sau khi sấy, tính bằng gam (g).
2.4.2 Xác định tính chất vật lý
Tính chất vật lý của tinh dầu phân tích dựa trên TCVN 11424:2016 về tinh dầu cam ngọt. Sau đây là một số tính chất của tinh dầu.
2.4.2.1 Màu sắc và mùi
* Xác định màu sắc và độ truyền suốt - Xác định màu sắc
Dùng ống hút lấy 20 ml mẫu cho vào ống nghiệm khô, sạch, trong suốt. Dùng mắt quan sát độ trong và màu sắc của tinh dầu.
- Xác định vị
Cân khoảng 1g tinh dầu cho vào đĩa petri khô, sạch. Nhỏ vài giọt nước vào đĩa tinh dầu, trộn đều, dùng lưỡi xác định vị của hỗn hợp đó.
- Xác định mùi
Nhỏ vài giọt tinh dầu lên giấy thấm khô, sạch. Dùng mũi xác định mùi của tinh dầu, cứ 15 phút xác định một lần, khoảng 4-5 lần.
2.4.2.2 Xác định tỉ trọng:
Tỉ trọng của tinh dầu là tỉ số của khối lượng tinh dầu ở 20oC với khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20oC.
- Chuẩn bị bình tỉ trọng
Bình tỉ trọng được rửa sạch bằng hỗn hợp sunfocromic, tráng kỹ bằng nước cất và súc lại bằng axeton, ete hặc etanol, làm khô bằng cách thổi vào bình một luồng khơng khí khơ, nóng hoặc sấy nhẹ ở 70 – 80oC tới khối lượng không đổi. Cân khối lượng của bình và nút chính xác tới 0,0002g. Trong đó, hỗn hợp sunfocromic được điều chế: hịa tan 60g kalibicromat trong 100ml axit sunfuric đậm đặc (H2SO4).
27
- Xác định khối lượng của nước cất
Rót nhẹ nước vào bình cao hơn vạch mức một chút, tránh khơng tạo bọt khi rót. Ngâm bình vào mơi trường điều nhiệt đã duy trì ở 20 ± 0,5oC ngập tới cổ lọ trong 30 phút tới khi nhiệt độ của nước trong bình đạt 20 ± 0,5oC. Dùng các giải giấy thấm hút bớt nước trong bình tới đúng vạch mức và thấm khô các giọt nước bám ở thành trong cổ bình, lau khơ cổ bình và đậy nút. Lấy bình ra khỏi mơi trường điều nhiệt, lau khơ và cân nhanh chính xác đến 0,0002g và làm khô.
- Xác định khối lượng của tinh dầu
Tiến hành chuẩn bị mẫu tinh dầu tương tự nhưng thay nước cất bằng tinh dầu ta xác định được khối lượng của bình và tinh dầu ở 200 ± 0,50C
- Tỷ trọng của tinh dầu ở 200Cđược xác định theo công thức sau:
20 20 d = m m m m 1 2
2.4.3.3 Chỉ số khúc xạ (được xác định ở 20oC theo phương pháp đo góc giới hạn bằng khúc xạ kế. )
Khúc xạ kế kiểu Abbe hoặc kiểu khác có đèn natri hay các bộ phân bổ chính triệt tiêu hiện tượng tán sắc và cho phép đọc được chỉ số khúc xạ từ 1,3000 đến 1,7000 với độ chính xác ± 0,0002. Cho dịng nước chảy qua máy để duy trì máy ở 20oC. Tiến hành hiệu chỉnh máy trước khi đo theo hướng dẫn cụ thể của từng loại máy. Mở hộp lăng kính, dùng bơng tẩm axeton hoặc exton lau kỹ lăng kính và thấm khơ bằng vải mềm hoặc bơng thấm nước.
Nhỏ 2 - 3 giọt tinh dầu lên mặt lăng kính mờ phía dưới và áp vào lăng kính bên trên. Khi nhiệt kế của khúc xạ kế chỉ 20oC, nhìn vào thị kính, chỉnh hiện tượng tán sắc nếu có rồi từ từ xoay bộ lăng kính đưa ranh giới giữa hai miền sáng và tối cắt đúng giao điểm của vạch. Đọc chỉ số khúc xạ ở ngang vạch chuẩn. Xác định lại vị trí và đọc chỉ số ba lần. Chỉ đọc chỉ số khúc xạ khi nhiệt độ đã ổn định. Kết quả là trung bình cộng của ba giá trị đọc được và làm tròn tới số thập phân thứ tư. Thực hiện lại với các mẫu tinh dầu khác nhau. Chỉ số khúc xạ được xác định bằng công thức sau:
28 NtD = Nt’D + 0,0004 (t’ – t) Trong đó: NtD - là chỉ số đọc được ở nhiệt độ “t”; t - nhiệt độ cần tính chuyển. 2.4.1.4 Xác định góc quay cực
Góc quay cực được xác định như sau:
Điều chỉnh máy: Đổ nước cất vào đầy ống của phân cực kế, chú ý tránh có bọt khí ở bên trong và vặn chặt nắp đậy của ống. Đặt ống vào máng của phân cực kế đã bật đèn sáng, xác định sai lệch của điểm o0 so với điểm 0 của du xích.
Đo góc quay cực: Lấy ống trong máy ra, tháo nước đi và lau ống cho thật khô. Đổ tinh dầu vào đầy ống và tiếp tục đo như khi điều chỉnh máy. Kết quả thu được cần hiệu chỉnh với độ sai lệch của điểm 0o so với điểm 0 của du xích để được giá trị đúng của góc quay cực. Tiến hành đo ít nhất 3 lần với cùng mẫu thử, kết quả là trung bình cộng của ba lần xác định liên tiếp có sai lệch giá trị không vượt quá 0,080. Sai số của phép đo không được vượt quá ± 0,170.
2.4.3 Phân tích thành phần hóa học
Trong phương pháp phân tích thành phần hóa học của hợp chất bay hơi trong tinh dầu người ta sử dụng kỹ thuật GC-MS. Kỹ thuật GC-MS là kỹ thuật sắc kỹ khí và khối phổ dựa vào khối lượng phân tử trên phổ đồ (mũi phân tử) và thời gian lưu (trên sắc kí đồ) để định danh các hợp chất [26, 27].
2.4.3.1 Cấu tạo máy GC-MS
Thiết bị GC-MS gồm: thiết bị sắc kí khí (GC) và thiết bị phân tích phổ khối lượng (MS). Thiết bị GC có cấu tạo: bộ phận cung cấp khí mang, bộ phân tiêm mẫu, lị cột, cột tách và thiết bị sau đưa vào MS. Nhiệm vụ là tách các chất với thời gian lưu khác nhau và lần lượt đưa chúng qua bộ phận ion hóa MS. Cấu tạo chung của MS gồm : nguồn ion, bộ phận tách khối và detector. Nhiệm vụ là tách các thành phần dựa trên sự khác biệt về giá trị m/z.
29
2.4.3.2 Nguyên tắc hoạt động
Thành phần hóa học của các hợp chất bay hơi trong tinh dầu được xác định bằng kỹ thuật GC – MS. Phân tích mẫu dầu được thực hiện trên máy sắc ký khí (GC) được trang bị cột mao quản FID và cột DB - 5,30m × 0,25mm, độ dày màng 0,25μm, nhiệt độ được lập trình như sau: 60−240°C tại 4°C/phút. Khí mang là N2 với lưu lượng 2,0ml / phút; cổng phun và nhiệt độ đầu dò lần lượt là 250°C và 300°C. Mẫu được tiêm bằng cách tách và tỷ lệ phân chia là 1:10. Phân tích GC/MS được thực hiện trên hệ thống Hewlett-packard 6890/5972 với cột mao quản DB-5 (30m × 0,25mm; độ dày màng 0,25 μm. Điều kiện hoạt động giống như mơ tả ở trên nhưng khí mang là He Phổ khối được lấy ở 70 eV. Phạm vi khối lượng quét là từ 40-400 m/z với tốc độ lấy mẫu là 1.0 lần quét/s. Dữ liệu định lượng thu được từ sự tích hợp điện tử của các vùng cực đại FID. được xác định bởi thời gian lưu của chúng, các chỉ số duy trì, liên quan đến C5 - C28n- ankan, máy tính phù hợp với thư viện WILEY275.L và cũng như bằng cách so sánh phổ khối của chúng với dữ liệu đã có sẵn trong tài liệu. Tỷ lệ thành phần của các hợp chất được xác định được tính tốn từ các khu vực đỉnh GC mà khơng có bất kỳ yếu tố hiệu chỉnh nào và được tính tốn tương đối. Việc phân tích tinh dầu là trung bình của ba lần