- Khúc xạ kế: tên thiết bị: ATC- 3E, Bix: 0-0.32%, hiệu: ATAGO sản xuất tại Nhật Bản
- Khúc xạ kế: tên thiết bị: ATC- 1E, Bix: 0-0.32%, hiệu: ATAGO sản xuất tại Nhật Bản
- Giấy đo pH - Cân phân tích - Cân điện tử - Máy ly tâm
- Bộ chưng cất rượu - Máy đo DO Oxi200
- Các thiết bị khác dùng trong các phương pháp xác định.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Sơ đồ quy trình
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình nghiên cứu
Nấm men thuần chủng Saccharomyces cerevisiae Dung dịch chất mang alginate 2% Rỉ đường
Nuôi sinh khối 121Thanh trùng ở oC, 15phút Xử lý
Ly tâm
Lên men Hòa trộn
Tạo gel trong dịch CaCl2 0,1M Sinh khối ẩm Điều chỉnh thành phần ở 20-22oBx Thanh trùng dịch ở 121oC, 15phút Chưng cất Xác định đường sót Ổn định hạt gel t0= 4oC, τ =12h Rửa hạt gel Dịch lên men Xác định độ rượu Thiết bị lên men
Thuyết minh quy trình
Dung dịch chất mang alginate 2%
Dung dịch alginate được pha với nồng độ alginate natri 2% (W/V) trong nước.
Thanh trùng dịch alginate 2%
Dung dịch alginate sau khi được pha ở nồng độ 2% được đem đi thanh trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút [8].
Hòa trộn
Sau khi đã chuẩn bị dịch huyền phù tế bào nấm men và dung dịch alginate xong thì đem trộn hai dịch này lại với nhau theo tỉ lệ 1:1, khuấy đảo bằng máy khuấy từ trong 1-2 phút cho đều.
Tạo hạt gel
Dùng pipet ở các kích thước khác nhau nhỏ từng giọt dung dịch hỗn hợp alginate và huyền phù tế bào vào dung dịch CaCl2 0,1M.
Ổn định hạt gel
Sau khi tạo hạt gel xong, các hạt gel được để yên trong dung dịch CaCl2 trong 12 giờ, ở 4oC để các ion Ca++ tiếp tục khuếch tán vào sâu trong hạt gel, hạt gel tiếp tục co rút, giảm khối lượng và cứng lại.
Rửa hạt gel
Rửa hạt gel bằng nước cất sau khi ổn định hạt gel trong CaCl2, nhằm giảm bớt lượng muối bám trên hạt gel trước khi lên men.
Lên men
Hạt gel sau khi được rửa xong thì được vào thiết bị lên men là bình có dung tích 1000ml đã có sẵn dịch rỉ đường cho một mẻ lên men. Tiến hành lên men ở điều kiện thường nhiệt độ phòng, trong thời gian 96 giờ. Sử dụng phương pháp lên men gián đoạn.
Chưng cất
Tiến hành chưng cất dịch giấm chín từ rỉ đường. Lấy 100ml dịch lọc giấm chín cho vào bình định mức 100ml, rót dịch giấm chín vào bình cất 1 rồi tráng bình bằng 100ml nước cất rồi đổ vào bình 1 có dung tích khoảng 500ml.
Chuẩn bị dịch rỉ đường
- Xử lý: dịch rỉ đường ban đầu có nồng độ khoảng 65oBx, pH= 5,6 không thể lên men rượu được mà phải xử lý pha loãng xuống 45oBx- 50oBx bằng nước cất, sau đó cho thêm 0,2% - 0,3% H2SO4 đặc, rỉ đường được pha loãng xuống 30oBx để có pH từ 4,5- 4,6, cho thêm 0,01%-0,02% KMnO4 để sát trùng và oxy hóa một số chất có trong rỉ đường. Đảo trộn, gia nhiệt đạt nhiệt độ dung dịch 80oC-85oC. Sau đó để lắng 3- 4 giờ, tách cặn và pha loãng xuống nồng độ theo yêu cầu lên men. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Điều chỉnh thành phần: Rỉ đường tại nhà máy đường Khánh Hòa có hàm lượng đường thấp phải bổ sung thêm đường saccharoza để tăng thêm cơ chất cho nấm men lên men, để điều chỉnh được pH thích hợp cho lên men thường dùng acid H3PO4 hoặc dung dịch kiềm NaOH 0,1N. Ngoài ra, nấm men còn cần đến vi lượng như: (NH4)2SO4, ure.
- Thanh trùng dịch rỉ đường: Rỉ đường sau khi xử lý và điều chỉnh thành phần được tiệt trùng ở 121oC, trong thời gian 15 phút.
Chuẩn bị sinh khối nấm men
Tế bào nấm men sau khi được phân lập và nuôi cấy được mang đi nuôi sinh khối trong môi trường Sabouraud. Sinh khối tế bào được tách ra bằng máy ly tâm, tốc độ 6000 vòng/phút, thời gian ly tâm 15 phút. Gạn bỏ phần nước, lấy phần rắn là tế bào nấm men ướt. Cho nước vào để pha tế bào theo tỉ lệ 15% theo khối lượng, ta thu được dịch huyền phù của các tế bào lơ lửng.
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến hiệu suất lên men - Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến thời gian lên men - Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa đến hiệu suất lên men - Đánh giá hiệu suất lên men
2.3.3. Bố trí thí nghiệm
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến hiệu suất lên men
Sau khi rửa hạt gel ở các kích thước khác nhau, ta cho hạt gel vào bình lên men. Mỗi bình lên men là một kích thước hạt gel. Tiến hành lấy dịch lên men ở các thời điểm sau 12, 24, 36, 48, 96h lên men trong các bình lên men để xác định hàm lượng đường
Dung dịch alginate và sinh khối nấm men theo tỉ lệ 1:1 Tạo hạt gel ở các kích thước pipet 1ml 2ml 5ml 10ml 25ml Ổn định hạt gel Rửa hạt gel
Thiết bị lên men chứa dịch rỉ đường đã chuẩn bị Dịch lên men Chưng cất Xác định lượng đường sót Xác định
độ rượu Xác định hiệu suất lên men
Chọn kích thước thích
hợp Lên men
sót và chưng cất xác định độ rượu. Dựa vào hàm lượng đường sót và độ rượu thu được ta xác định được hiệu suất lên men ở các kích thước và từ đó có thể chọn được kích thước hạt gel lên men thích hợp.
2.3.3.2. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của phƣơng pháp hoạt hóa tế bào cố định đến hiệu suất lên men
Quy trình nghiên cứu được thực hiện sau chu kỳ lên men thứ 4 của quá trình lên men gián đoạn. Sau chu kỳ lên men thứ 4 thì tế bào cố định có khả năng bị giảm hoạt lực do đó hiệu suất lên men rượu sẽ giảm, vì vậy sau mỗi chu kỳ lên men muốn tận dụng khả năng lên men của tế bào cố định thì ta phải hoạt hóa nó. Có hai phương pháp để hoạt hóa tế bào cố định:
Phương pháp thứ nhất là hạt gel sau khi lên men chu kỳ 4, được rửa sạch bằng dung dịch muối sinh lý và cho vào dịch rỉ đường lên men. Không khí được sục vào KMnO4 0,1% để vô trùng và sục vào lòng dung dịch lên men chứa các hạt gel
Phương pháp thứ hai là sau khi hạt gel lên men chu kỳ 4, được rửa bằng dung dịch muối sinh lý và cho hạt gel vào môi trường có thành phần giống với môi trường nuôi sinh khối nấm men, sau 12h hoạt hóa tế bào thì lấy tế bào cố định ra và cho vào dịch rỉ đường lên men
Phương pháp thứ nhất tiết kiệm thời gian lên men và khả năng hoạt hóa cũng khá tốt. Với phương pháp này điều cần quan tâm đến đó là thời gian sục khí và nồng độ oxy hòa tan (DO).
Trong phạm vi đề tài này chỉ quan tâm đến phương pháp thứ nhất, đó là phương pháp sục khí.
Quá trình nghiên cứu được thực hiện sau chu kỳ lên men thứ 4 của quá trình lên men gián đoạn. Quy trình nghiên cứu theo sơ đồ sau :
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa đến hiệu suất lên men
Sau khi lên men chu kỳ 4, hạt gel được lấy ra đem đi rửa bằng nước muối sinh lý 9/1000. Khi rửa xong, hạt gel được cho vào bình lên men có chứa dịch rỉ đường đã chuẩn bị. Không khí được sục vào KMnO4 0,1% để vô trùng và sục vào lòng dung dịch lên men chứa các hạt gel ở các thời gian sục khí 5, 10, 15, 20 phút. Sau khi sục khí tiếp tục cho dung dịch lên men và lấy dịch lên men sau 12h để xác định hàm lượng đường sót, chung cất xác định độ rượu. Dựa vào hàm lượng đường sót và độ rượu thu được ta xác định được hiệu suất lên men và từ đó có thể xác định được thời gian sục khí thích hợp.
2.3.4. Phƣơng pháp xử lý nguyên liệu và nuôi cấy tế bào nấm men Phƣơng pháp xử lý nguyên liệu
Nguyên liệu ban đầu là dịch rỉ đường 65oBx, pH= 5,6 không thể lên men rượu được mà phải xử lý pha loãng xuống 45oBx- 500Bx bằng nước cất, sau cho 0,2% - 0,3% H2SO4 đặc, rỉ đường được pha loãng xuống 30oBx để có pH từ 4,5- 4,6, cho
Hạt gel sau lên men lần 4
Bình lên men có chứa dịch rỉ đường đã chuẩn bị Xác định lượng đường sót Lên men Sục khí ở các thời gian khác nhau 5, 10, 15, 20 phút Dịch lên men Chưng cất Xác định hiệu
suất lên men Chọn thời gian sục khí thích hợp Nhiệt độ phòng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thêm 0,01%-0,02% KMnO4 để sát trùng và oxy hóa một số chất có trong rỉ đường. Đảo trộn, gia nhiệt đạt nhiệt độ dung dịch 80oC-85oC. Sau đó để lắng bốn giờ, tách cặn và pha loãng xuống nồng độ theo yêu cầu lên men.
Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào nấm men
- Nuôi cấy tế bào: dùng môi trường Sabouraud [5] - Môi trường sinh khối tế bào [5]
Nuôi cấy tế bào trên thạch nghiêng: sau khi pha môi trường đem đi thanh trùng 121oC, trong 15 phút. Dùng que cấy cấy nấm men lên thạch nghiêng, ủ 1 ngày, ở 30oC.
Nhân giống tạo sinh khối: cho 10 ml nước cất vào trong ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng đã chuẩn bị, dùng que cấy làm đồng đều nấm men ở dạng huyền phù. Tiếp đó, đếm số lượng nấm men bằng buồng đếm.
Môi trường sinh khối sau khi pha được đem đi thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau đó bổ sung 1ml nấm men vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường. Trong khoảng 24h-36h nuôi ở nhiệt độ thường 30 – 32oC, trên máy lắc ngang ở 160 vòng/phút cho nấm men phát triển tối đa. Sau đó dịch mang đi li tâm 15 phút, tốc độ 6000 vòng/phút, thu được sinh khối nấm men.
2.3.5. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu 2.3.5.1. Phƣơng pháp phân tích
Xác định hàm lượng chất khô của rỉ đường (oBx) bằng khúc xạ kế ATC Xác định hàm lượng đường ban đầu trong rỉ đường và hàm lượng đường sót trong dịch giấm chín bằng phương pháp Graxianop [6].
Xác định số tế bào nấm men bằng phương pháp đếm [14].
Xác định độ cồn bằng cồn kế.
Xác định hiệu suất lên men: hiệu suất lên men là tỉ lệ % giữa độ rượu thu được so với độ rượu theo lý thuyết [2].
Xác định DO bằng máy đo Oxi200
2.3.5.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê (Deseriptive Statistic, Anova single - factor, Ducan Test) với mức ý nghĩa p < 0,05 và vẽ đồ thị trên phần mền MS Excel 2003 và Spss 16.0.
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của kích thƣớc hạt đến hiệu suất lên men rƣợu 3.1.1. Ảnh hƣởng của kích thƣớc hạt gel đến thời gian lên men
Các hạt gel được tạo ở các kích thước pipet 1, 2, 5, 10, 25ml được cho vào các bình lên men có dịch rỉ đường đã chuẩn bị: 13- 15% glucose tương ứng với 20,67mg glucose/ml; pH = 5. Tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng, sau mỗi 12h, 24h, 36h, 48h, 96h lấy 50ml dịch lên men ra để xác định đường sót và 100ml đem chưng cất để xác định độ rượu. Từ hàm lượng đường sót và độ cồn sẽ xác định được hiệu suất lên men.
Kết quả được thể hiện trên hình 3.1 và bảng 3.1 (phụ lục 1)
0 5 10 15 20 25 0h 12h 24h 36h 48h 96h
Thời gian lên men
L ượn g đư ờn g só t t ro ng d ịc h lê n m en (m g/ m l)
Lên men ở kích thước hạt gel 1ml Lên men ở kích thước hạt gel 2ml Lên men ở kích thước hạt gel 5ml Lên men ở kích thước hạt gel 10ml Lên men ở kích thước hạt gel 25ml
Hình 3.1: Lượng đường sót trong dịch lên men theo thời gian ở các kích thước
Dựa vào biểu đồ thể hiện lượng đường sót trong dịch lên men theo thời gian ở các kích thước hạt gel khác nhau, ta thấy lượng đường sót giảm theo thời gian lên men. Nhìn chung tốc độ lên men ở tất cả các kích thước hạt gel đều giảm mạnh trong khoảng thời gian nhỏ hơn 24h lên men. Có thể giải thích điều này là do nấm men sử dụng đường làm cơ chất để tạo ra rượu etylic, CO2 và các sản phẩm khác cho nên theo thời gian lượng đường sót ở trong dịch lên men giảm dần.
Để dễ so sánh và theo dõi sự ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến quá trình lên men chọn thời điểm mà hàm lượng đường sót còn lại 5mg/ml (đây là thời điểm mà hiệu suất lên men đạt khoảng 70- 80%) ở các bình lên men có kích thước hạt gel 1, 2, 5, 10, 25 ml để xác định thời gian lên men, hiệu quả lên men tốt nhất và dễ nhận ra nhất trong cả quá trình lên men.
Kết quả thí nghiệm về thời gian lên men khi hàm lượng đường sót là 5mg/ml ở các kích thước hạt gel khác nhau được thể hiện trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Thời gian lên men để đường sót 5mg/ml
Kết quả nghiên cứu cho thấy thời điểm để đạt được hàm lượng đường sót là 5mg/ml khác nhau theo kích thước hạt gel, trong đó thời lên men ở bình lên men có kích thước hạt gel 25ml là ngắn nhất (34h), và tăng dần theo thứ tự kích thước hạt gel là 10, 5, 2, 1ml. Có thể giải thích điều này là do kích thước hạt gel càng lớn thì lỗ xốp trong hạt lớn, làm cho cơ chất khuếch tán tốt hơn, độ bền lớn hơn và ổn đinh trong thời gian dài.
Kích thước hạt gel
Thời điểm hàm lượng đường còn sót 5 (mg/ml) 1ml 41h 2ml 39h 5ml 38h 10ml 35h 25ml 34h (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Như vậy xét về mặt thời gian khi lên men ở kích thước hạt gel 25ml ta sẽ rút ngắn được thời gian lên men so với các kích thước hạt khác, tuy nhiên để quyết định chọn kịch thước hạt gel nào thì cần so sánh với hiệu suất lên men
3.1.2. Ảnh hƣởng của kích thƣớc hạt gel đến hiệu suất lên men
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến hiệu suất lên men được thể hiện trên hình 3.2 và bảng 3.3 (phụ lục 1)
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 12h 24h 36h 48h 96h
Thời gian lên men
H iệ u su ất lê n m en ( %
) Lên men ở kích thước hạt
gel 1ml
Lên men ở kích thước hạt gel 2ml
lên men ở kích thước hạt gel 5ml
Lên men ở kích thước hạt gel 10ml
Lên men ở kích thước hạt gel 25ml
Hình 3.2: Hiệu suất lên men theo thời gian ở các kích thước hạt gel 1, 2, 5, 10, 25ml
Dựa vào biểu đồ, ta thấy hiệu suất lên men tăng lên theo thời gian lên men ở tất cả các kích thước hạt gel, tuy nhiên sau 48h hiệu suất lên men đã có xu hướng giảm. Nguyên nhân là do khi lên men nấm men sử dụng đường làm cơ chất để tạo ra rượu etylic, CO2 và các sản phẩm khác, theo thời gian lên men lượng đường trong dịch lên men sẽ giảm dần, đồng thời lượng rượu tạo ra tăng lên dẫn đến hiệu suất lên men tăng, nhưng sau 48h lên men cơ chất trong dịch lên men không còn nhiều cho nấm men sử dụng nên hoạt lực cũng yếu dần dẫn đến hiệu suất lên men bắt đầu giảm.
Để dễ so sánh và theo dõi sự tác động của kích thước hạt gel đến hiệu suất lên