Khi nghiên cứu cố định tế bào có hai vấn đề quan trọng để có thể khai thác hiệu quả các tế bào cố định. Thứ nhất là sản phẩm sau khi cố định phải có hoạt tính xúc tác sinh học mạnh và kéo dài. Độ bền của sản phẩm cố định là điều quan trọng thứ hai.
Đối với việc cố định các tế bào để lên men rượu thì các tác giả cũng tập trung vào hai vấn đề này. Có nhiều phương pháp cố định tế bào và các chất mang khác
nhau dùng vào mục đích cố định. Nhưng có lẽ phương pháp được nghiên cứu nhiều nhất là bẫy các tế bào trong mạng lưới gel của alginate với ion đa hóa trị. Việc tạo gel của alginate là do việc hình thành các liên kết ngang có chọn lọc với các ion đa hóa trị. Tính chất chọn lọc là đặc trưng đối với các phân đoạn polyguluronat, còn đối với phân đoạn polymanuronat và luân hợp hầu như không có tính chất lựa chọn này. Tính lựa chọn cao đối với các ion tương tự nhau như các kim loại kiềm thổ (Mg<< Ca << Sr << Ba) cho thấy sự tương tác giữa alginate và các ion này không hoàn toàn là tĩnh điện mà còn do một số tính chất phức tạp khác của phân đoạn polyguluronat do cấu trúc đặc biệt của phân đoạn này mang lại.
Sự tạo gel của alginate có thể được tiến hành theo 2 phương pháp: phương pháp khuếch tán và phương pháp tạo gel bên trong
Phương pháp khuếch tán được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật cố định. Theo phương pháp này các ion tạo gel ở bên ngoài giọt dung dịch alginate natri và khuếch tán vào bên trong giọt. Như vậy quá trình tạo gel sẽ xảy ra bên trong giọt dung dịch alginate và sau đó phát triển vào bên trong. Phương pháp này có đặc điểm là động học tạo gel nhanh và đặc điểm tạo gel nhanh đó được ứng dụng cho mục đích cố định các tác nhân hoạt tính như enzyme hay tế bào.
Khi nhỏ một giọt dung dịch alginate natri vào dung dịch CaCl2, các ion Ca++ sẽ tác dụng rất nhanh với các phân tử alginate ở bề mặt giọt dung dịch vào quá trình tạo gel bắt đầu. Vùng gel ở bề mặt sẽ tiến dần vào bên trong làm cho hạt gel bị co rút, nước thoát ra và thể tích giảm đi. Hoạt tính của alginate và của ion tạo gel tại vùng này sẽ bằng không. Cùng với sự liên kết giữa các phân tử trên bề mặt, sự tạo gel sẽ kéo các phân tử từ vùng trung tâm chưa tạo gel ra vùng có hoạt tính bằng không và làm cho nồng độ alginate tại trung tâm giảm đi. Các ion Ca++ sau đó tiếp tục khuếch tán sâu vào bên trong lòng hạt gel nhưng vì nồng độ alginate ở trung tâm giảm đi nên mạng lưới gel ở trong thưa hơn. Mặt khác do mạng lưới gel mặt ngoài dày hơn, sự khuếch tán của ion Ca++ vào sâu bên trong sẽ chậm hơn. Quá trình tạo gel như vậy tạo nên sự không đồng thể của hạt gel. Người ta thấy rằng sự phân bố alginate trên bề mặt có thể tăng lên 5 lần trong khi nồng độ alginate ở trung tâm
xem như bằng không. Như vậy trong quá trình tạo gel có hai chuyển động ngược chiều nhau. Thứ nhất là lớp gel bề mặt chuyển động dần về phía trung tâm. Thứ hai là alginate chuyển động từ trung tâm ra vùng hoạt tính bằng không và tạo nên vùng có hàm lượng nước cao ở trung tâm hạt gel. Quá trình tạo gel có thể được minh họa trên hình 1.7 :
Hình 1.7. Quá trình tạo gel alginate canxi theo phương pháp khuếch tán
Tính đồng thể của hạt gel có thể được điều chỉnh bằng các thông số chi phối quá trình tạo gel. Tính không đồng thể lớn nhất có thể đạt được bằng cách dùng alginate có phân tử lượng thấp, nồng độ ion tạo gel nhỏ và không có mặt các ion không tạo gel. Tính đồng thể lớn nhất có thể đạt khi alginate có phân tử lượng lớn và nồng độ cao của cả hai loại ion tạo gel và không tạo gel. Độ bền của hạt gel phụ thuộc vào nồng độ alginate, nồng độ ion tạo gel. Khi nồng độ alginate và nồng độ ion tạo gel tăng lên thì độ bền hạt gel tăng lên, người ta cho thấy độ bền hạt gel không phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng của alginate. Với alginate có phân tử lượng lớn hơn 100 kDa thì hầu như độ bền của hạt gel không phụ thuộc vào khối lượng phân tử alginate.
Đối với phương pháp tạo gel bên trong, quá trình tạo gel dựa trên việc cho các ion tạo liên kết ngang ở dạng vô hoạt vào trong dung dịch alginate natri. Ví dụ như ion canxi thì ở dạng CaCO3, CaSO4 hoặc ở dạng phức hợp với các tác nhân càng hóa như
Ca++ = Ca++ khuếch tán vào Hướng co rút của bề mặt hạt gel Alginate natri Hướng dịch chuyển của alginate từ trung tâm ra ngoài Ca++
EDTA, xitrat,…Khi thay đổi pH, các ion Ca++ sẽ được giải phóng ra dần dần. Quá trình tạo gel chậm sẽ tạo ra gel có tính đồng thể cao.
Hiện nay phương pháp phổ biến để cố định tế bào là phương pháp khuếch tán. Phương pháp nhẹ nhàng này cho phép giữ được sự sống của các tế bào. Nhưng các tác nhân gây càng hóa như photphat, đệm xitrat cũng dễ làm vỡ các hạt gel. Khi nồng độ alginate tăng lên thì độ bền của hạt gel tăng lên nhưng khi nồng độ tế bào tăng lên thì rõ ràng là có tác dụng ngược lại, khi nồng độ alginate tăng lên thì khả năng khuếch tán của các chất vào trong hạt gel giảm. Nhiều thí nghiệm [18] đã cho thấy hạt gel chỉ cho các chất có phân tử lượng nhỏ khuếch tán vào còn các chất có phân tử lượng lớn như protein, tinh bột thì không khuếch tán được vào trong hạt gel. Hannoun & Stephanopoulous (1986) [18] cho thấy khả năng khuếch tán của glucoza và rượu etylic vào trong mạng lưới gel alginate 2% thì cũng tương tự như nước nhưng khả năng khuếch tán sẽ giảm đi khi nồng độ alginate tăng, nhưng Estape D. và cộng sự cho thấy khi khuếch tán đồng thời glucoza và rượu etylic vào trong hạt gel thì hệ số khuếch tán đều giảm đi. Đối với glucoza giảm 14% còn rượu etylic là 28%. Rochefort Rehg & Chau (1986) [18] thấy rằng độ bền hạt gel tăng lên hai lần khi dùng Al(NO)3 0,1 M để xử lý hạt gel alginate canxi. Để tăng độ bền hạt gel Christian Vogelsang & Kjetill Ostgaard còn bổ sung các ion Ca++, Ba++ vào môi trường xung quanh hạt gel [16].
Để tạo hạt gel khá bền nhiều tác giả sử dụng dung dịch alginate 2% để tạo gel. Nicolas M. Veling & Michele M, Mestdagh [17] đã nghiên cứu các tính chất hóa lý của hạt gel và cho thấy độ bền của hạt gel phụ thuộc vào nồng độ cation tạo gel, sự co rút, pH,… Sự co rút hạt gel cũng được tác giả Ngô Đăng Nghĩa nghiên cứu [9].
Nồng độ đường trong môi trường lên men thì nằm trong khoảng 5-20%. Một số tác giả sử dụng nồng độ 25% nhưng tốc độ phản ứng cũng không tăng hiệu suất. Nguồn nguyên liệu để lên men cũng rất đa dạng từ nguyên liệu glucoza, rỉ đường, dịch sữa đến dịch chiết trái cây.
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu chính - rỉ đƣờng
Rỉ đường được thu mua từ nhà máy đường Khánh Hòa
Hình 2.1. Rỉ đường sau khi thu mua.
2.1.2. Nguyên liệu phụ 2.1.2.1. Alginate 2.1.2.1. Alginate
Alginate có công thức phân tử (C6H7NaO6)n, khối lượng phân tử là 198,11. Alginate được sản xuất tại phòng thí nghiệm của trường ĐH Nha Trang.
2.1.2.2. Canxi clorua
Canxi clorua ngậm nước dạng khan có công thức phân tử CaCl2.2H2O. Canxi clorua được mua từ đại lý phân phối Đại Dương, số 04 Bắc Sơn.
2.1.2.3. Nấm men
Nấm men Saccharomyces cerevisiae, có đặc tính chịu được độ cồn cao khoảng 130-150, được phân lập và nuôi cấy tại phòng vi sinh trường ĐH Nha Trang
2.1.3. Các dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Khúc xạ kế: tên thiết bị: ATC- 3E, Bix: 0-0.32%, hiệu: ATAGO sản xuất tại Nhật Bản
- Khúc xạ kế: tên thiết bị: ATC- 1E, Bix: 0-0.32%, hiệu: ATAGO sản xuất tại Nhật Bản
- Giấy đo pH - Cân phân tích - Cân điện tử - Máy ly tâm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Bộ chưng cất rượu - Máy đo DO Oxi200
- Các thiết bị khác dùng trong các phương pháp xác định.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Sơ đồ quy trình
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình nghiên cứu
Nấm men thuần chủng Saccharomyces cerevisiae Dung dịch chất mang alginate 2% Rỉ đường
Nuôi sinh khối 121Thanh trùng ở oC, 15phút Xử lý
Ly tâm
Lên men Hòa trộn
Tạo gel trong dịch CaCl2 0,1M Sinh khối ẩm Điều chỉnh thành phần ở 20-22oBx Thanh trùng dịch ở 121oC, 15phút Chưng cất Xác định đường sót Ổn định hạt gel t0= 4oC, τ =12h Rửa hạt gel Dịch lên men Xác định độ rượu Thiết bị lên men
Thuyết minh quy trình
Dung dịch chất mang alginate 2%
Dung dịch alginate được pha với nồng độ alginate natri 2% (W/V) trong nước.
Thanh trùng dịch alginate 2%
Dung dịch alginate sau khi được pha ở nồng độ 2% được đem đi thanh trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút [8].
Hòa trộn
Sau khi đã chuẩn bị dịch huyền phù tế bào nấm men và dung dịch alginate xong thì đem trộn hai dịch này lại với nhau theo tỉ lệ 1:1, khuấy đảo bằng máy khuấy từ trong 1-2 phút cho đều.
Tạo hạt gel
Dùng pipet ở các kích thước khác nhau nhỏ từng giọt dung dịch hỗn hợp alginate và huyền phù tế bào vào dung dịch CaCl2 0,1M.
Ổn định hạt gel
Sau khi tạo hạt gel xong, các hạt gel được để yên trong dung dịch CaCl2 trong 12 giờ, ở 4oC để các ion Ca++ tiếp tục khuếch tán vào sâu trong hạt gel, hạt gel tiếp tục co rút, giảm khối lượng và cứng lại.
Rửa hạt gel
Rửa hạt gel bằng nước cất sau khi ổn định hạt gel trong CaCl2, nhằm giảm bớt lượng muối bám trên hạt gel trước khi lên men.
Lên men
Hạt gel sau khi được rửa xong thì được vào thiết bị lên men là bình có dung tích 1000ml đã có sẵn dịch rỉ đường cho một mẻ lên men. Tiến hành lên men ở điều kiện thường nhiệt độ phòng, trong thời gian 96 giờ. Sử dụng phương pháp lên men gián đoạn.
Chưng cất
Tiến hành chưng cất dịch giấm chín từ rỉ đường. Lấy 100ml dịch lọc giấm chín cho vào bình định mức 100ml, rót dịch giấm chín vào bình cất 1 rồi tráng bình bằng 100ml nước cất rồi đổ vào bình 1 có dung tích khoảng 500ml.
Chuẩn bị dịch rỉ đường
- Xử lý: dịch rỉ đường ban đầu có nồng độ khoảng 65oBx, pH= 5,6 không thể lên men rượu được mà phải xử lý pha loãng xuống 45oBx- 50oBx bằng nước cất, sau đó cho thêm 0,2% - 0,3% H2SO4 đặc, rỉ đường được pha loãng xuống 30oBx để có pH từ 4,5- 4,6, cho thêm 0,01%-0,02% KMnO4 để sát trùng và oxy hóa một số chất có trong rỉ đường. Đảo trộn, gia nhiệt đạt nhiệt độ dung dịch 80oC-85oC. Sau đó để lắng 3- 4 giờ, tách cặn và pha loãng xuống nồng độ theo yêu cầu lên men.
- Điều chỉnh thành phần: Rỉ đường tại nhà máy đường Khánh Hòa có hàm lượng đường thấp phải bổ sung thêm đường saccharoza để tăng thêm cơ chất cho nấm men lên men, để điều chỉnh được pH thích hợp cho lên men thường dùng acid H3PO4 hoặc dung dịch kiềm NaOH 0,1N. Ngoài ra, nấm men còn cần đến vi lượng như: (NH4)2SO4, ure.
- Thanh trùng dịch rỉ đường: Rỉ đường sau khi xử lý và điều chỉnh thành phần được tiệt trùng ở 121oC, trong thời gian 15 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị sinh khối nấm men
Tế bào nấm men sau khi được phân lập và nuôi cấy được mang đi nuôi sinh khối trong môi trường Sabouraud. Sinh khối tế bào được tách ra bằng máy ly tâm, tốc độ 6000 vòng/phút, thời gian ly tâm 15 phút. Gạn bỏ phần nước, lấy phần rắn là tế bào nấm men ướt. Cho nước vào để pha tế bào theo tỉ lệ 15% theo khối lượng, ta thu được dịch huyền phù của các tế bào lơ lửng.
2.3.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến hiệu suất lên men - Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến thời gian lên men - Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa đến hiệu suất lên men - Đánh giá hiệu suất lên men
2.3.3. Bố trí thí nghiệm
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của kích thước hạt gel đến hiệu suất lên men
Sau khi rửa hạt gel ở các kích thước khác nhau, ta cho hạt gel vào bình lên men. Mỗi bình lên men là một kích thước hạt gel. Tiến hành lấy dịch lên men ở các thời điểm sau 12, 24, 36, 48, 96h lên men trong các bình lên men để xác định hàm lượng đường
Dung dịch alginate và sinh khối nấm men theo tỉ lệ 1:1 Tạo hạt gel ở các kích thước pipet 1ml 2ml 5ml 10ml 25ml Ổn định hạt gel Rửa hạt gel
Thiết bị lên men chứa dịch rỉ đường đã chuẩn bị Dịch lên men Chưng cất Xác định lượng đường sót Xác định
độ rượu Xác định hiệu suất lên men
Chọn kích thước thích
hợp Lên men
sót và chưng cất xác định độ rượu. Dựa vào hàm lượng đường sót và độ rượu thu được ta xác định được hiệu suất lên men ở các kích thước và từ đó có thể chọn được kích thước hạt gel lên men thích hợp.
2.3.3.2. Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của phƣơng pháp hoạt hóa tế bào cố định đến hiệu suất lên men
Quy trình nghiên cứu được thực hiện sau chu kỳ lên men thứ 4 của quá trình lên men gián đoạn. Sau chu kỳ lên men thứ 4 thì tế bào cố định có khả năng bị giảm hoạt lực do đó hiệu suất lên men rượu sẽ giảm, vì vậy sau mỗi chu kỳ lên men muốn tận dụng khả năng lên men của tế bào cố định thì ta phải hoạt hóa nó. Có hai phương pháp để hoạt hóa tế bào cố định:
Phương pháp thứ nhất là hạt gel sau khi lên men chu kỳ 4, được rửa sạch bằng dung dịch muối sinh lý và cho vào dịch rỉ đường lên men. Không khí được sục vào KMnO4 0,1% để vô trùng và sục vào lòng dung dịch lên men chứa các hạt gel
Phương pháp thứ hai là sau khi hạt gel lên men chu kỳ 4, được rửa bằng dung dịch muối sinh lý và cho hạt gel vào môi trường có thành phần giống với môi trường nuôi sinh khối nấm men, sau 12h hoạt hóa tế bào thì lấy tế bào cố định ra và cho vào dịch rỉ đường lên men
Phương pháp thứ nhất tiết kiệm thời gian lên men và khả năng hoạt hóa cũng khá tốt. Với phương pháp này điều cần quan tâm đến đó là thời gian sục khí và nồng độ oxy hòa tan (DO).
Trong phạm vi đề tài này chỉ quan tâm đến phương pháp thứ nhất, đó là phương pháp sục khí.
Quá trình nghiên cứu được thực hiện sau chu kỳ lên men thứ 4 của quá trình lên men gián đoạn. Quy trình nghiên cứu theo sơ đồ sau :
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm xác định ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa đến hiệu suất lên men
Sau khi lên men chu kỳ 4, hạt gel được lấy ra đem đi rửa bằng nước muối sinh lý 9/1000. Khi rửa xong, hạt gel được cho vào bình lên men có chứa dịch rỉ đường đã chuẩn bị. Không khí được sục vào KMnO4 0,1% để vô trùng và sục vào lòng dung dịch lên men chứa các hạt gel ở các thời gian sục khí 5, 10, 15, 20 phút. Sau khi sục khí tiếp tục cho dung dịch lên men và lấy dịch lên men sau 12h để xác định