Hình 3.4. Hình thái cây địa lan con dưới ảnh hưởng của thành phần đa lượng và nồng độ BA
Phương pháp nuôi cấy mô có thể tạo ra những cây giống sạch khuẩn và nấm mốc nhưng không đảm bảo cây hoàn toàn sạch virus.
Theo quan sát, tôi nhận thấy một số cây địa lan con được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm có biểu hiện không tốt: cây khằn, một số ít lá có đốm vàng hoặc nâu.
Với những lý do trên, tôi tiến hành tách đỉnh sinh trưởng địa lan và nuôi cấy nhằm tạo ra những cây sạch bệnh.
Ở đây, tôi chọn những cây địa lan non từ nuôi cấy mô để tách đỉnh sinh trưởng mà không phải là đỉnh sinh trưởng của chồi non bên ngoài, nguyên nhân là:
+Việc tách đỉnh sinh trưởng từ chồi non khá khó, do đỉnh sinh trưởng của nó được bao bọc trong nhiều lớp lá ôm chặt.
+Số lượng chồi non không nhiều, không đủ cho việc khảo sát môi trường thích hợp để đỉnh sinh trưởng phát sinh PLB.
+Việc tách đỉnh sinh trưởng từ cây mô dễ dàng hơn.
Tuy các mô địa lan thường sản sinh các hợp chất phenol làm mẫu hóa nâu, nhưng đỉnh sinh trưởng chứa các mô phân sinh nên sẽ không sinh ra những hợp chất này. Do đó, ngoài việc khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng tôi còn khảo sát tác động của than hoạt tính đối với việc phát sinh PLB của đỉnh sinh trưởng.
STT Nghiệm thức (mg/l)BA (mg/l)NAA Than hoạt tính (g/l) Tỷ lệ ĐST hình thành PLB Hình thái PLB
1 N0 0 0 0 40% To, có phát sinh chồi
2 N01 0.1 40% Trung bình 3 N02 0.3 40% Trung bình 4 N03 0.5 10% To 5 N11 0.5 0.1 20% Trung bình 6 N12 0.3 40% Trung bình 7 N13 0.5 20% To 8 N21 1 0.1 20% To 9 N22 0.3 50% To, có phát sinh PLB 10 N23 0.5 10% To, có phát sinh PLB
11 TN0 0 0 0.5 30% To, có phát sinh chồi
12 TN01 0.1 10% Nhỏ 13 TN02 0.3 30% Trung bình 14 TN03 0.5 30% To 15 TN11 0.5 0.1 20% Trung bình 16 TN12 0.3 30% Trung bình 17 TN13 0.5 30% To 18 TN21 1 0.1 20% Trung bình 19 TN22 0.3 30% To 20 TN23 0.5 40% To, có phát sinh PLB
Kết quả ở bảng 3.4 và biểu đồ 3.4 được quan sát như sau:
Nhìn chung đỉnh sinh trưởng trong môi trường có than hoạt tính (0.5 mg/l) có tỉ lệ hình thành PLB thấp hơn hẳn môi trường không có than hoạt tính. Nguyên nhân có thể là do than hoạt tính làm chậm sự sinh trưởng của mô non đồng thời hấp thu một phần chất điều hòa tăng trưởng. Điều đó thể hiện rõ ở chỗ các đỉnh sinh trưởng ở môi trường không than hình thành PLB tốt ở nồng độ NAA 0.3 mg/l, trong khi ở môi trường có than các PLB lại hình thành tốt ở nồng độ 0.5 mg/l.
Tuy nhiên, sau khi PLB đã hình thành trên môi trường không than thì phải cấy chuyền sang môi trường nhân nhanh thích hợp có than hoạt tính do trong quá trình sinh trưởng, phát triển chúng có thể sản sinh các hợp chất phenol.
Một điều đặc biệt ở đây là các đỉnh sinh trưởng trên môi trường không hề có chất điều hòa tăng trưởng (N0) lại có tỉ lệ hình thành PLB cũng khá cao. Nguyên nhân có thể là do hàm lượng auxin nội sinh cũng như dư lượng auxin ngoại sinh ở thí nghiệm trước tập trung ở đỉnh sinh trưởng. Tuy nhiên, các PLB này sau khi hình thành lại nhanh chóng phát sinh chồi mà không phát sinh PLB.
Các PLB ở môi trường có nồng độ chất điều hòa tăng trưởng cao (đặc biệt là NAA) lại có xu hướng tiếp tục phát sinh PLB.
Đa số các PLB mới hình thành đều có hình thái khá chuẩn nhưng tỉ lệ hình thành còn chưa cao. Nguyên nhân có thể là do đỉnh sinh trưởng khá yếu chưa kịp thích nghi với môi trường hoặc bị dập trong quá trình thao tác.
Kết luận: Trong thí nghiệm này, môi trường N22 (không có than hoạt tính, 1mg /l BA, 0.3 mg/l NAA) là thích hợp cho đỉnh sinh trưởng hình thành PLB.
PHẦN 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận
Nhân nhanh vô tính và tạo giống sạch bệnh là một quá trình khá phức tạp gồm nhiều công đoạn. Dựa vào những kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu tôi đưa ra kết luận như sau:
Quy trình gồm 4 giai đoạn chính:
1. Tạo nguồn PLB nguyên liệu
Chồi non của địa lan là vật liệu được dùng để tạo ra nguồn PLB ban đầu phục vụ cho quá trình nhân nhanh.
Mô phân sinh của những chồi non này được nuôi cấy trên môi trường có thành phần đa lượng Knudson C; 0,5g/l than hoạt tính; 1mg/l BA; 0,5mg/l NAA và các thành phần cơ bản khác có khả năng phát sinh và cho số lượng PLB nhiều hơn hẳn.
2. Nhân nhanh PLB
PLB thu được ở giai đoạn trên được cắt làm 2 hoặc 3 (tùy theo kích thước PLB) rồi cấy vào môi trường có thành phần đa lượng Knudson C; 0,5g/l than hoạt tính; 0,5mg/l NAA và các thành phần cơ bản khác. Sau 12 tuần, chúng sẽ cho một số lượng lớn PLB chuẩn.
Từ một chồi non ban đầu, số PLB thu được sau quá trình nhân nhanh sẽ là: 3 × 4,5 × 2,5 × 13,5 = 456 (PLB)
Trong đó:
• 3: Số mô phân sinh trung bình trên một chồi non
• 4,5: Số PLB trung bình phát sinh từ một mô phân sinh
• 2,5: Số lát cắt trung bình từ một PLB
• 13,5: Số PLB trung bình phát sinh trên một cụm sau giai đoạn nhân nhanh
3. Tạo cây hoàn chỉnh
Các PLB phát sinh chồi được cấy sang môi trường có thành phần đa lượng M; 0,5g/l than hoạt tính; 1mg/l BA. Sau 9 tuần tiếp theo, các cây con có đầy đủ lá và rễ sẽ hình thành với hình thái tốt hơn hẳn, có đủ sức thích nghi nếu được đem ra ngoài trồng.
4. Tách đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh
Đỉnh sinh trưởng được tách từ cây mô sẽ được cấy vào môi trường có thành phần đa lượng Knudson C; không có than hoạt tính; 1mg/l BA; 0,3mg/l NAA và các thành phần cơ bản khác. Sau 12 tuần, các PLB sẽ hình thành.
Những PLB này phải được cấy chuyền sang môi trường nhân nhanh chứa than hoạt tính.
Môi trường K + 1mg/l BA + 0.5mg/l NAA 12 tuần Môi trường K + 0,5mg/l NAA 12 tuần Môi trường M + 1mg/l BA 9 tuần Tách đỉnh sinh trưởng Môi trường K + 1mg/l BA + 0,3mg/l NAA 12 tuần Môi trường K + 0,5mg/l NAA 12 tuần Ra vườn
Hình 4.1. Quy trình nhân nhanh vô tính và tạo giống sạch bệnh ở địa lan Xanh Chiểu
4.2 Kiến nghị
Do thời gian tiến hành thí nghiệm còn han hẹp nên nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến việc nhân nhanh và tạo giống sạch bệnh ở địa lan còn chưa được khảo sát. Vì vậy tôi có một số kiến nghị như sau:
- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng than hoạt tính và agar trong môi trường đến khả năng phát sinh PLB và tạo cây hoàn chỉnh ở địa lan.
- Khảo sát thêm khả năng phát sinh PLB trên môi trường lỏng.
- Tiến hành test virus những cây địa lan con để khẳng định cây hoàn toàn sạch bệnh.
- Không thể áp dụng kết quả trên cho những giống địa lan khác mà chỉ dựa vào đó để khảo sát thêm.
- Khảo sát sức sống của cây địa lan con ở điều kiện ex vitro
Phần V: TÀI LIỆU THAM KHẢO
Giáo trình CNSH Thực Vật, Ths. Bùi Văn Thế Vinh, Hutech, 2011. Giáo trình CNSH Thực Vật, Đh Khoa Học Tự Nhiên Tp, HCM, 2010 Tạp chí cây cảnh Việt Nam.