cho việc nhân nhanh PLB
Như ta đã biết, môi trường Knudson C là môi trường thông dụng trong nuôi cấy mô các giống lan. Bên cạnh đó, môi trường M (được cung cấp bởi phòng thí nghiệm) cũng được biết là thích hợp cho nuôi cấy mô địa lan. Do đó trong thí nghiệm này, tôi tiến hành so sánh ảnh hưởng của hai đa lượng trên đối với việc nhân nhanh PLB.
Song song với quá trình đó, tôi cũng tiến hành khảo sát khoảng nồng độ NAA thích hợp, bởi auxin là một chất đóng vai trò chính trong cảm ứng tạo phôi.
Sau 12 tuần nuôi cấy, kết quả của việc nhân nhanh được quan sát như sau:
1 MN1
M
0.5 8.0 ± 0.6 To, xanh, có lông hút
2 MN2 1 7.3 ± 0.3 To, xanh, không có
lông hút 3 MN3 1.5 4.3 ± 0.7 To, xanh, có phát sinh chồi 4 MN4 2 3.7 ± 0.3 Trung bình, xanh, hơi khằn
5 MN5 2.5 3.3 ± 0.3 Trung bình, hơi khằn
6 KN1
K
0.5 13.3 ± 0.9 To, xanh, có lông hút
7 KN2 1 10.3 ± 0.9 To, xanh, không có
lông hút 8 KN3 1.5 5.7 ± 0.3 To, xanh, không có lông hút 9 KN4 2 4.7 ± 0.3 Trung bình, có phát sinh chồi
10 KN5 2.5 3.3 ± 0.7 Trung bình, hơi khằn
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng và nồng độ NAA trong việc nhân nhanh PLB.
Theo kết quả trên, tôi nhận thấy số lượng PLB hình thành trên một cụm ở các nghiệm thức môi trường K cao hơn hẳn môi trường M. Mặt khác, ở môi trường này các PLB cũng đồng đều và ít hình thành chồi non hơn.
Điều khác biệt giữa hai môi trường này là môi trường M có thêm urea (CO(NH2)2) và acid citric (C6H807), hàm lượng (NH4)2SO4 và KCl của nó cũng cao hơn nhiều.
Urea là một chất hữu cơ tổng hợp, có tác dụng bổ sung đạm cho thực vật. Trong môi trường, nó sẽ kết hợp với nước tạo (NH4)2CO3, NH4+ sẽ được cây hấp thu. Rõ ràng môi trường M có lượng đạm khá cao, đều này có thể kích thích PLB mới hình thành phát sinh chồi và rễ tạo cây hoàn chỉnh do đó không phù hợp với việc nhân nhanh PLB.
Acid citric là một chất khử giúp ngăn chặn quá trình oxy hóa các hợp chất phenol (một chất được sinh ra từ mô lan) do đó tránh được hiện tượng hóa nâu của mẫu. Bên cạnh đó, than hoạt tính trong môi trường cũng làm nhiệm vụ hấp thu các hợp chất phenol. Như vậy nhiệm vụ này của than hoạt tính trong môi trường M ít hơn nhờ
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng và nồng độ NAA trong việc nhân nhanh PLB
sự hỗ trợ của acid citric. Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác.
Xét về ảnh hưởng của NAA, các PLB hình thành với số lượng lớn ở các nồng độ NAA là 0.5 và 1 mg/l.
Kết luận: Trong thí nghiệm này, môi trường đa lượng Knudson C với nồng độ NAA dưới 1 mg/l là thích hợp để nhân nhanh PLB địa lan.
Hình 3.2. Hình thái một số PLB đặc trưng trong thí nghiệm khảo sát thành phần đa lượng và khoảng nồng độ NAA đối với quá trình nhân nhanh
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng trên môi trường K đối với sự phát sinh PLB
Dựa vào kết quả của thí nghiệm trên, tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng trên môi trường đa lượng Knudson C để tìm ra môi trường thích hợp nhất cho việc nhân nhanh PLB.
Trong thí nghiệm này, ngoài các nghiệm thức môi trường bổ sung NAA với nồng độ nhỏ hơn 1mg/l, tôi còn khảo sát thêm ảnh hưởng của NAA kết hợp với BA.
Sau 12 tuần nuôi cấy, kết quả quan sát được như sau:
STT Nghiệm thức BA (mg/l) NAA (mg/l) Số PLB trung bình Hình thái PLB 1 KN01 0
0.1 7.0 ± 0.3 Trung bình, màu nhạt, ít lông hút 2 KN02 0.3 11.0 ± 1.8 To, xanh, có lông hút
3 KN03 0.5 13.5 ± 1.0 To, xanh, có lông hút
4 KN04 0.7 9.7 ± 0.6 Trung bình, các PLB chưa tách biệt
5 KN11
0.5
0.1 6.5 ± 0.9 Nhỏ, có lông hút, có phát sinh chồi 6 KN12 0.3 9.4 ± 1.1 Trung bình, nhiều lông hút
7 KN13 0.5 12.9 ± 0.9 To, có lông hút, có phát sinh chồi 8 KN14 0.7 9.6 ± 0.8 To, không có lông hút, ít phát sinh chồi 9 KN21 1 0.1 8.6 ± 1.2 Trung bình, có lông hút, phát sinh chồi 10 KN22 0.3 8.8 ± 0.6 To, xanh, có lông hút
11 KN23 0.5 13.6 ± 0.8 To, không có lông hút, có phát sinh chồi
12 KN24 0.7 4.3 ± 0.3 To, ít lông hút, PLB chưa tách biệt rõ 13 KN31 1.5 0.1 6.0 ± 0.4 Trung bình, không có lông hút
14 KN32 0.3 6.7 ± 0.6 To, ít lông hút, có phát sinh chồi 15 KN33 0.5 7.2 ± 0.6 To, ít lông hút, có phát sinh chồi 16 KN34 0.7 8.0 ± 0.9 To, ít lông hút, PLB chưa tách biệt rõ 17 KN41 2 0.1 4.1 ± 0.6 To, ít lông hút, có phát sinh chồi 18 KN42 0.3 5.8 ± 0.5 To, ít lông hút, có phát sinh chồi 19 KN43 0.5 5.8 ± 0.3 To, PLB chưa tách biệt rõ
20 KN44 0.7 2.8 ± 0.7 To, PLB chưa tách biệt rõ
Bảng 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng trong việc nhân nhanh PLB
Ở thí nghiệm này, tôi chú ý đến số PLB phát sinh từ mẫu cấy ban đầu, từ đó khảo sát xem môi trường nào thích hợp cho mục đích nhân nhanh. Theo bảng 3.3 và biểu đồ 3.3, kết quả được quan sát như sau:
+Xét về ảnh hưởng của NAA, các PLB trung bình trên một cụm tăng dần ở các nồng độ NAA 0.1 mg/l; 0.3 mg/l; 0.5 mg/l, sau đó giảm ở nồng độ 0.7 mg/l.
+Xét về ảnh hưởng của BA:
•Số PLB trung bình trên một cụm ở các nghiệm thức BA nồng độ 0.5 mg/l; 1 mg/l và không bổ sung BA gần như không có sự khác biệt.
•Đối với các nghiệm thức BA 1.5 mg/l và 2 mg/l, số PLB trung bình trên một cụm thấp hơn hẳn. Mặt khác, tỉ lệ BA càng cao thì số lượng PLB phát sinh chồi càng nhiều. Điều này không thích hợp cho việc nhân nhanh PLB, bởi theo quan sát tôi thấy các PLB phát sinh chồi có xu hướng tạo cây hoàn chỉnh hơn là việc phát sinh PLB.
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng trong việc nhân nhanh PLB
Theo kết quả này, số PLB được tạo ra ở các nghiệm thức KN03 và KN23 là cao nhất. Tuy nhiên, xét về mặt hình thái các PLB ở nghiệm thức KN23 có phát sinh chồi trong khi các PLB ở nghiệm thức KN03 thì không xảy ra hiện tượng này.
Ngoài ra, trong khi quan sát sự phát sinh của các PLB tôi cũng nhận thấy số lượng PLB hình thành ở những mẫu được cắt theo chiều ngang nhiều hơn ở những mẫu được cắt theo chiều dọc. Nguyên nhân có thể là do lát cắt ngang dễ hấp thu các chất trong môi trường hơn và những tế bào bề mặt phát sinh phôi trên cùng một lát cắt đồng nhất về tuổi hơn.
Kết luận: Trong thí nghiệm này, nghiệm thức KN03 với 0.5 mg/l NAA thích hợp cho việc nhân nhanh PLB.
Hình 3.3. Một số hình thái PLB đặc trưng trong thí nghiệm khảo sát môi trường chuẩn cho việc nhân nhanh PLB
3.3 Tạo cây hoàn chỉnh
Trong thí nghiệm này, tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của BA trong việc kích thích PLB phát sinh cây hoàn chỉnh. Bởi BA là một cytokinin có ảnh hưởng trong việc tạo chồi cũng như kích thích sự phân chia tế bào.
Thông qua thí nghiệm khảo sát môi trường thích hợp cho việc nhân nhanh PLB, tôi nhận thấy tỉ lệ PLB hình thành chồi trên môi trường đa lượng M cao hơn. Do đó, trong thí nghiệm này, tôi cũng tiến hành so sánh tác động của hai thành phần đa lượng M và Knudson C đối với hình thái của cây con.
Ở đây tôi chọn những PLB đã hình thành chồi để tránh trường hợp phát sinh PLB tiếp theo cũng như tăng độ đồng đều của cây con.
Sau 3 tuần nuôi cấy, các chồi phát triển dài ra và rễ cũng bắt đầu xuất hiện. Rễ được hình thành là nhờ vào lượng auxin nội sinh từ mô phân sinh đỉnh thân và trong lá non của chồi đỉnh được vận chuyển xuống gốc.
Kết quả sau 9 tuần nuôi cấy được quan sát như sau:
STT Nghiệm
thức trườngMôi (mg/l)BA Hình thái cây con
Số lá Chiều dài lá (cm) Số rễ Chiều dài rễ (cm)
1 MC1 M 0.5 23 3.5 ± 0.5 23 1.0 ± 0.3 2 MC2 1 35 4.0 ± 0.5 34 2.0 ± 0.7 3 MC3 1.5 23 4.0 ± 1.0 12 1.0 ± 0.4 4 MC4 2 23 4.0 ± 1.5 12 1.5 ± 0.5 5 KC1 K 0.5 34 3.0 ± 0.5 23 2.5 ± 1.0 6 KC2 1 34 4.5 ± 1.0 24 1.5 ± 1.0 7 KC3 1.5 23 6.0 ± 2.0 12 2.5 ± 0.5 8 KC4 2 23 5.0 ± 1.0 12 2.0 ± 5.0
Bảng 3.4. Khảo sát môi trường thích hợp cho việc tạo cây hoàn chỉnh
Theo kết quả trên, tôi nhận thấy tất cả các môi trường khảo sát đều cho cây hoàn chỉnh, có đủ rễ và lá.
+Xét về ảnh hưởng của BA, chiều dài lá tăng khi nồng độ BA tăng.
• Ở nghiệm thức BA 1,5 mg/l và 2 mg/l: lá và rễ tuy dài nhưng ốm, số lượng lá và rễ cũng không nhiều.
• Ở nghiệm thức BA 1 mg/l: số lượng lá và rễ nhiều, lá và rễ cũng mập hơn và có chiều dài tương đối. Cây con với hình thái này có khả năng thích ứng tốt hơn khi đưa ra vườn.
+Xét về ảnh hưởng của thành phần đa lượng, môi trường M tác động tốt hơn hẳn, lá và rễ mập và cứng cáp hơn. Có lẽ thành phần chất khoáng cao ở môi trường này đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng của cây.
Kết luận: Trong các môi trường khảo sát, môi trường MC2 là thích hợp nhất cho việc tạo cây hoàn chỉnh.
3.4 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh
Hình 3.4. Hình thái cây địa lan con dưới ảnh hưởng của thành phần đa lượng và nồng độ BA
Phương pháp nuôi cấy mô có thể tạo ra những cây giống sạch khuẩn và nấm mốc nhưng không đảm bảo cây hoàn toàn sạch virus.
Theo quan sát, tôi nhận thấy một số cây địa lan con được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm có biểu hiện không tốt: cây khằn, một số ít lá có đốm vàng hoặc nâu.
Với những lý do trên, tôi tiến hành tách đỉnh sinh trưởng địa lan và nuôi cấy nhằm tạo ra những cây sạch bệnh.
Ở đây, tôi chọn những cây địa lan non từ nuôi cấy mô để tách đỉnh sinh trưởng mà không phải là đỉnh sinh trưởng của chồi non bên ngoài, nguyên nhân là:
+Việc tách đỉnh sinh trưởng từ chồi non khá khó, do đỉnh sinh trưởng của nó được bao bọc trong nhiều lớp lá ôm chặt.
+Số lượng chồi non không nhiều, không đủ cho việc khảo sát môi trường thích hợp để đỉnh sinh trưởng phát sinh PLB.
+Việc tách đỉnh sinh trưởng từ cây mô dễ dàng hơn.
Tuy các mô địa lan thường sản sinh các hợp chất phenol làm mẫu hóa nâu, nhưng đỉnh sinh trưởng chứa các mô phân sinh nên sẽ không sinh ra những hợp chất này. Do đó, ngoài việc khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng tôi còn khảo sát tác động của than hoạt tính đối với việc phát sinh PLB của đỉnh sinh trưởng.
STT Nghiệm thức (mg/l)BA (mg/l)NAA Than hoạt tính (g/l) Tỷ lệ ĐST hình thành PLB Hình thái PLB
1 N0 0 0 0 40% To, có phát sinh chồi
2 N01 0.1 40% Trung bình 3 N02 0.3 40% Trung bình 4 N03 0.5 10% To 5 N11 0.5 0.1 20% Trung bình 6 N12 0.3 40% Trung bình 7 N13 0.5 20% To 8 N21 1 0.1 20% To 9 N22 0.3 50% To, có phát sinh PLB 10 N23 0.5 10% To, có phát sinh PLB
11 TN0 0 0 0.5 30% To, có phát sinh chồi
12 TN01 0.1 10% Nhỏ 13 TN02 0.3 30% Trung bình 14 TN03 0.5 30% To 15 TN11 0.5 0.1 20% Trung bình 16 TN12 0.3 30% Trung bình 17 TN13 0.5 30% To 18 TN21 1 0.1 20% Trung bình 19 TN22 0.3 30% To 20 TN23 0.5 40% To, có phát sinh PLB
Kết quả ở bảng 3.4 và biểu đồ 3.4 được quan sát như sau:
Nhìn chung đỉnh sinh trưởng trong môi trường có than hoạt tính (0.5 mg/l) có tỉ lệ hình thành PLB thấp hơn hẳn môi trường không có than hoạt tính. Nguyên nhân có thể là do than hoạt tính làm chậm sự sinh trưởng của mô non đồng thời hấp thu một phần chất điều hòa tăng trưởng. Điều đó thể hiện rõ ở chỗ các đỉnh sinh trưởng ở môi trường không than hình thành PLB tốt ở nồng độ NAA 0.3 mg/l, trong khi ở môi trường có than các PLB lại hình thành tốt ở nồng độ 0.5 mg/l.
Tuy nhiên, sau khi PLB đã hình thành trên môi trường không than thì phải cấy chuyền sang môi trường nhân nhanh thích hợp có than hoạt tính do trong quá trình sinh trưởng, phát triển chúng có thể sản sinh các hợp chất phenol.
Một điều đặc biệt ở đây là các đỉnh sinh trưởng trên môi trường không hề có chất điều hòa tăng trưởng (N0) lại có tỉ lệ hình thành PLB cũng khá cao. Nguyên nhân có thể là do hàm lượng auxin nội sinh cũng như dư lượng auxin ngoại sinh ở thí nghiệm trước tập trung ở đỉnh sinh trưởng. Tuy nhiên, các PLB này sau khi hình thành lại nhanh chóng phát sinh chồi mà không phát sinh PLB.
Các PLB ở môi trường có nồng độ chất điều hòa tăng trưởng cao (đặc biệt là NAA) lại có xu hướng tiếp tục phát sinh PLB.
Đa số các PLB mới hình thành đều có hình thái khá chuẩn nhưng tỉ lệ hình thành còn chưa cao. Nguyên nhân có thể là do đỉnh sinh trưởng khá yếu chưa kịp thích nghi với môi trường hoặc bị dập trong quá trình thao tác.
Kết luận: Trong thí nghiệm này, môi trường N22 (không có than hoạt tính, 1mg /l BA, 0.3 mg/l NAA) là thích hợp cho đỉnh sinh trưởng hình thành PLB.
PHẦN 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận
Nhân nhanh vô tính và tạo giống sạch bệnh là một quá trình khá phức tạp gồm nhiều công đoạn. Dựa vào những kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu tôi đưa ra kết luận như sau:
Quy trình gồm 4 giai đoạn chính:
1. Tạo nguồn PLB nguyên liệu
Chồi non của địa lan là vật liệu được dùng để tạo ra nguồn PLB ban đầu phục vụ cho quá trình nhân nhanh.
Mô phân sinh của những chồi non này được nuôi cấy trên môi trường có thành phần đa lượng Knudson C; 0,5g/l than hoạt tính; 1mg/l BA; 0,5mg/l NAA và các thành phần cơ bản khác có khả năng phát sinh và cho số lượng PLB nhiều hơn hẳn.
2. Nhân nhanh PLB
PLB thu được ở giai đoạn trên được cắt làm 2 hoặc 3 (tùy theo kích thước PLB) rồi cấy vào môi trường có thành phần đa lượng Knudson C; 0,5g/l than hoạt tính; 0,5mg/l NAA và các thành phần cơ bản khác. Sau 12 tuần, chúng sẽ cho một số lượng lớn PLB chuẩn.
Từ một chồi non ban đầu, số PLB thu được sau quá trình nhân nhanh sẽ là: 3 × 4,5 × 2,5 × 13,5 = 456 (PLB)
Trong đó:
• 3: Số mô phân sinh trung bình trên một chồi non
• 4,5: Số PLB trung bình phát sinh từ một mô phân sinh
• 2,5: Số lát cắt trung bình từ một PLB
• 13,5: Số PLB trung bình phát sinh trên một cụm sau giai đoạn nhân nhanh
3. Tạo cây hoàn chỉnh
Các PLB phát sinh chồi được cấy sang môi trường có thành phần đa lượng M;