SLP@mPEG-Chol Kích thước hạt (nm) Hệ số đa phân tán (PDI) Thế zeta (mV) SLP@mPEG550-Chol 115,50 ± 2,88 0,228 ± 0,02 -84,00 ± 10,31 SLP@mPEG1100-Chol 120,72 ± 2,48 0,347 ± 0,031 -67,47 ± 6,54 SLP@mPEG5000-Chol 139,83 ± 6,02 0,245 ± 0,059 -63,83 ± 1,87 SLP@mPEG10000-Chol 195,40 ± 6,61 0,229 ± 0,012 -46,73 ± 0,29 SLP@mPEG20000-Chol 214,93 ± 1,50 0,405 ± 0,009 -40,17 ± 1,93
Kết quả DLS cho thấy sự phân bố kích thước trong khoảng từ 115,50 nm đến 214,93 nm và phụ thuộc vào khối lượng phân tử của mPEG được ghép với cholesterol (mPEG-Chol). Điều này chứng tỏ rằng có sự hình thành liposome thơng qua tương tác kỵ nước của lecithin, cholesterol, CTAB và mPEG-Chol. Trong môi trường nước, các phân tử này sẽ tự lắp rắp để hình thành liposome. Các kết quả này
cũng cho thấy rằng khi khối lượng phân tử của mPEG tăng sẽ làm tăng kích thước của liposome do mPEG ưa nước sẽ càng cồng kềnh khi khối lượng phân tử càng tăng. Tổng hợp hệ nanoliposome biến tính PEG ứng dụng làm hệ mang thuốc điều trị ung thư, vì vậy, chúng tơi chọn mPEG5000-Chol có kết quả tổng hợp SLP@mPEG-Chol với kích thước hạt < 200 nm (kích thước lý tưởng cho hệ mang thuốc). Nghiên cứu cũng sử dụng mPEG5000 để tổng hợp vật liệu mPEG-CS và mPEG-Gel.
b. Kết quả khảo sát nồng độ mPEG-Chol
Trong khảo sát nồng độ mPEG-Chol, nanoliposome biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-Chol đã được sử dụng để nang hóa thuốc chống ung thư paclitaxel (PTX) và carboplatin (CAR). Kết quả DLE và DLC của 5 nồng độ mPEG-Chol được thể hiện trên Hình 3.3.
Hình 3.3. Hiệu suất mang thuốc (a) và khả năng mang thuốc (b) của hệ
SLP@mPEG-Chol ở các nồng độ mPEG-Chol
Kết quả trong Hình 3.3 cho thấy sự gia tăng nồng độ mPEG-Chol dẫn đến
thay đổi hiệu suất nang hóa thuốc. Khi nồng độ mPEG-Chol tăng từ 2% lên 4%, DLE tăng dần từ 82,84% lên 87,48% đối với PTX và tăng từ 64,34% đến 70,30% đối với CAR. Tuy nhiên, DLE không tăng thêm mà giảm dần khi nồng độ mPEG- Chol tăng lên đến 10%. Kết quả này cho thấy rằng nồng độ mPEG-Chol có tác động
đáng kể đến DLE [76,77]. Hiệu quả tải thuốc của SLP@mPEG-Chol được phát hiện là cao nhất ở nồng độ mPEG-Chol là 4%. Liposome với nồng độ PEG cao hơn cho khả năng hòa tan nhiều hơn và lưu giữ trong máu lâu hơn so với liposome với nồng độ PEG thấp hơn hoặc khơng biến tính PEG [78]. Tuy nhiên, sự gia tăng nồng độ khả năng trên 5% có thể cản trở sự thâm nhập của thuốc trong quá trình chuẩn bị SLP@mPEG-Chol mang thuốc. Do đó, nồng độ mPEG-Chol 4% được sử dụng trong tổng hợp hệ nanoliposome biến tính PEG bằng mPEG-Chol.
3.2.2.2. Kết quả nang hóa thuốc
a. Kết quả phân tích phổ FT-IR
SLP@mPEG-Chol nang hóa PTX (PTX/SLP@mPEG-Chol) và CAR (CAR/SLP@mPEG-Chol) thông qua tương tác kỵ nước. Trong môi trường hydrat, nanoliposome mang thuốc tự lắp ráp nhờ vào tương tác kỵ nước. Trong đó, PTX sẽ nằm trong lớp đôi phospholipid và CAR sẽ nằm trong khoang nước của liposome.
Hình 3.4. Phổ FT-IR của SLP, mPEG-Chol, PTX/SLP@mPEG-Chol và
CAR/SLP@mPEG-Chol
Trên phổ FT-IR của PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol (Hình 3.4) cho thấy xuất hiện đồng thời các dao động đặc trưng của cả
nanoliposome (SLP) và mPEG-Chol ở1384 cm-1 là dao động C-O và 2965 cm-1 là dao động C-H của chuỗi acid béo trên lecithin của SLP; 2900 cm-1 là dao động hóa trị C-H của nhóm CH2, 1758 cm-1 của nhóm -NHCOO- và 1177 cm-1 của nhóm C- O-C trên mPEG-Chol.
1690 cm-1 là dao động C=C và 1278 cm-1 là dao động C-N trên PTX xuất hiện trên PTX/SLP@mPEG-Chol. Đặc trưng cho liên kết Pt-NH2 xuất hiện ở 1399 và 1392 cm-1 trên CAR đều xuất hiện trên CAR/SLP@mPEG-Chol [79].
Dữ liệu phổ FT-IR của SLP, mPEG-Chol, PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol theo Hình 3.4 được thống kê qua Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả phổ FT-IR của SLP, mPEG-Chol, PTX/SLP@mPEG-Chol và
CAR/SLP@mPEG-Chol Vị trí Nhóm chức Số sóng (cm-1) SLP mPEG -Chol SLP@ mPEG- Chol PTX CAR PTX/SLP @mPEG- Chol CAR/SLP @mPEG- Chol a -CH2 2900 2913 2922 2913 b C-O-C 1177 1121 1111 1147 e -NHCOO- 1758 1788 1783 1754 g C-O- 1384 1303 1385 1303 1286 h C-H 2965 2987 2978 2954 i C=C 1690 1693 k C-N 1278 1294 l Pt-NH2 1399 - 1392 1441
Qua bảng thống kê dữ liệu phổ của các chất (Bảng 3.8) cho thấy sự lặp lại các tín hiệu dao động đặc trưng trên phân tử mPEG-Chol ở vị trí a, b, c và trên phân tử SLP ở vị trí e, f ln xuất hiện trong phân tử PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol sau khi tổng hợp. Trong phổ đồ của PTX/SLP@mPEG-
Chol xuất hiện các dao động ở vị trí g, h chứng tỏ đã nang hóa thành cơng PTX vào SLP@mPEG-Chol. Phổ đồ của CAR/SLP@mPEG-Chol xuất hiện tín hiệu dao động tại vị trí i chứng tỏ đã nang hóa thành cơng CAR vào SLP@mPEG-Chol.
b. Kết quả TEM và DLS PTX/SLP@mPEG-Chol
Hình 3.5. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của
PTX/SLP@mPEG-Chol
Hệ nanoliposome biến tính PEG bằng vật liệu mPEG-Chol với nồng độ đã khảo sát là 4% mang thuốc PTX cho kết quả kích thước hạt trung bình là 161,80 nm với hệ số đa phân tán là 0,364 ± 0,026 và thế zeta mang điện tích âm (-54,30 ± 1,40 mV). Hình dạng và hình thái của PTX/SLP@mPEG-Chol được quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua được thể hiện trong Hình 3.5.c. Kết quả TEM cho thấy PTX/SLP@mPEG-Chol có dạng hình cầu đồng nhất.
CAR/SLP@mPEG-Chol
Kết quả cho thấy kích thước trung bình của CAR/SLP@mPEG-Chol là 169,6 ± 0,5 nm với hệ số đa phân tán nhỏ (PDI < 0,05) và kiểu phân bố 1 đỉnh. Bên cạnh
đó, hình TEM cho thấy các hạt tạo ra có sự phân bố đều khơng bị kết tụ, không bị vỡ hạt.
Hình 3.6. Kết quả DLS (a), thế zeta (b) và TEM scale 200 nm (c) của
CAR/SLP@mPEG-Chol
Đối với các hệ nano ứng dụng mang thuốc, kích thước hạt nhỏ hơn 200 nm được chứng minh là cho thời gian lưu thông dài trong hệ thống mạch máu. Bên cạnh đó, PDI từ 0,08 đến 0,7 cho biết hệ số đa phân tán ở mức trung bình và PDI dưới 0,3 là phân bố hẹp. Trong khi đó, giá trị tuyệt đối của thế zeta > 30 mV tốt hơn cho sự ổn định thể chất của keo [60,80]. Những kết quả này cho thấy rằng các hệ nanoliposome được biến tính bề mặt bằng mPEG-Chol có tiềm năng ứng dụng làm hệ mang thuốc điều trị ung thư.
3.2.2.3. Kết quả đánh giá độ ổn định trong huyết thanh
Kết quả khảo sát độ ổn định trong huyết thanh của PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol được thể hiện trong Hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả đánh giá sự thay đổi độ đục (được biểu thị bằng độ hấp thu) của
PTX/SLP@mPEG-Chol (a, b) và CAR/SLP@mPEG-Chol (c, d) khi ủ với 50% FBS Kết quả khảo sát độ ổn định trong huyết thanh cho thấy rằng độ hấp thu của PTX/SLP@mPEG-Chol và CAR/SLP@mPEG-Chol có sự thay đổi trong 4 giờ đầu và duy trì ổn định trong 24 giờ tiếp theo. Trong khi đó, PTX/SLP và CAR/SLP cho thấy sự lắng cặn khi thời gian khảo sát tăng. Kết quả này cho thấy nanoliposome được biến tính PEG bằng mPEG-Chol làm tăng tính ổn định của hệ nanoliposome trong huyết thanh so với nanoliposome chưa biến tính.
3.2.2.4. Kết quả đánh giá khả năng phóng thích thuốc
Kết quả phóng thích thuốc PTX ngun liệu, PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol trong mơi trường PBS (pH 7,4) được thể hiện trong Hình 3.8.
Hình 3.8. Kết quả phóng thích thuốc PTX ngun liệu, PTX được nang hóa trong
SLP và SLP@mPEG-Chol trong mơi trường PBS (pH 7,4)
Kết quả cho thấy thuốc PTX ngun liệu được phóng thích với tốc độ nhanh hơn rất nhiều so với thuốc PTX được nang hóa trong nanoliposome và nanoliposome biến tính PEG. Trong 6 giờ đầu khảo sát, kết quả cho thấy có khoảng 55% PTX nguyên liệu được phóng thích, trong khi chỉ có 18% PTX được phóng thích từ SLP và khoảng 13% PTX được phóng thích từ SLP@mPEG-Chol và duy trì tốc độ phóng thích đến 48 giờ khảo sát. Sau 48 giờ khảo sát, 18,11% PTX được phóng thích từ PTX/SLP@mPEG, 21,60% PTX được phóng thích từ PTX/SLP và 60,06% PTX ngun liệu được phóng thích. Từ kết quả phóng thích thuốc của PTX ngun liệu, PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol cho thấy kiểu phóng thích đặc trưng theo hai giai đoạn: giai đoạn đầu phóng thích nhanh và giai đoạn thứ hai là phóng thích chậm và cuối cùng là khơng đổi. Sự phóng thích nhanh vào giai đoạn đầu được thấy ở PTX nguyên liệu. Quá trình thủy phân của liposome đòi hỏi thời gian lâu hơn trong các điều kiện của thực nghiệm so với thuốc nguyên liệu. Do đó, giai đoạn thứ hai của q trình phóng thích chậm được giải thích là do
ái lực của các thành phần trong lớp màng lipid của liposome đối với thuốc PTX được nang hóa ở giữa hai lớp màng.
Mơ hình động học phóng thích thuốc:
Các tham số giải phóng động học và hệ số hồi quy được tính tốn từ bốn mơ hình động học phóng thích thuốc in vitro của PTX nguyên liệu và PTX được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol được trình bày trong Bảng 3.9.
Bảng 3.9. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của PTX nguyên liệu, PTX được nang
hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol thu được thơng qua mơ hình động học bậc khơng, mơ hình động học bậc một, mơ hình Higuchi và mơ hình Korsmeyer-Peppas
Mơ hình bậc khơng Mơ hình bậc một Mơ hình Higuchi Mơ hình Korsmeyer- Peppas k0 R2 kf R2 kH R2 kK n R2 PTX 0,5081 0,5107 0,0030 0,5202 3,8331 0,6408 33,312 0,1750 0,7816 PTX/SLP 0,1883 0,5959 0,0010 0,6136 1,3745 0,7251 11,442 0,1875 0,8307 PTX/SLP@ mPEG- Chol 0,1178 0,6230 0,0006 0,6341 1,2381 0,7962 9,587 0,1761 0,9153
Từ kết quả trong Bảng 3.9, đối với mơ hình bậc khơng giá trị R2 của PTX là 0,5107, PTX/SLP là 0,5959 và PTX/SLP@mPEG-Chol là 0,6230. Mơ hình bậc một, giá trị R2 của PTX là 0,5202, PTX/SLP là 0,6136 và PTX/SLP@mPEG-Chol là 0,6341. Mơ hình Higuchi, giá trị R2 của PTX là 0,6408, PTX/SLP là 0,7251 và PTX/SLP@mPEG-Chol là 0,7962. Mơ hình Korsmeyer-Peppas, giá trị R2 của PTX là 0,7816, PTX/SLP là 0,8307 và PTX/SLP@mPEG-Chol là 0,9153. Đối với mỗi mơ hình động học tương ứng, dạng phóng thích của PTX được nang hóa trong cả hai hệ liposome là SLP và SLP@mPEG-Chol đều cho thấy mối tương quan cao nhất với mơ hình Korsmeyer-Peppas (R2 = 0,8307 đối với PTX/SLP và R2 = 0,9153 đối với PTX/SLP@mPEG-Chol, Hình 3.9.d). Giá trị số mũ mô tả cơ chế khuếch tán của thuốc ra khỏi hệ chất mang (n) đối với PTX/SLP là 0,1875 và đối với PTX/SLP@mPEG-Chol là 0,1761; hai giá trị này đều nhỏ hơn 0,45. Do đó, theo mơ
hình Korsmeyer-Peppas, cả hai hệ SLP và SLP@mPEG-Chol đều cho sự phóng thích thuốc tn theo khuếch tán Fickian [66]. Bên cạnh đó, hằng số tốc độ (Kk) cho thấy đã được giảm bởi quá trình nang hóa thuốc vào SLP và SLP@mPEG-Chol (kk = 33,312 đối với PTX; kk = 11,442 đối với PTX/SLP và kk = 9,587 đối với PTX/SLP@mPEG-Chol). Điều này phù hợp với thảo luận trước đây về ảnh hưởng của thuốc được nang hóa vào hệ liposome đối với q trình phóng thích thuốc. Trong đó, việc biến tính bề mặt liposome bằng mPEG-Chol cho thấy việc kéo dài phóng thích thc PTX được thể hiện qua hằng số kk giảm ở hệ PTX/SLP@mPEG- Chol so với PTX/SLP.
Hình 3.9. Mơ hình động học giải phóng thuốc PTX ngun liệu, PTX từ PTX/SLP và
PTX/SLP@mPEG-Chol thơng qua bốn mơ hình động học: (a) Mơ hình bậc khơng, (b) Mơ hình bậc một, (c) Mơ hình Higuchi và (d) Mơ hình Korsmeyer-Peppas
b. Carboplatin
Kết quả phóng thích thuốc CAR ngun liệu, CAR được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol trong mơi trường PBS (pH 7,4) được thể hiện trong Hình 3.10.
Hình 3.10. Kết quả phóng thích thuốc CAR ngun liệu, CAR được nang hóa trong
SLP và SLP@mPEG-Chol trong mơi trường PBS (pH 7,4)
Kết quả Hình 3.10 cho thấy cả hai hệ đều cho thấy cơ chế phóng thích giống nhau. Sự phóng thích hồn toàn của thuốc CAR nguyên liệu xảy ra trong 48 giờ; trong khi thuốc được phóng thích từ hệ liposome và liposome được biến tính cho thấy phóng thích nhanh vào giai đoạn đầu, phóng thích chậm và khơng đổi vào giai đoạn hai. Cơ chế phóng thích thuốc theo hai giai đoạn được quan sát thấy ở hệ nanolipsome chưa biến tính cho thấy 51,57% CAR được phóng thích ra khỏi hệ sau 48 giờ cao hơn so với hệ nanolipsome đã biến tính với 31,43% CAR được phóng thích. Kết quả trên cho thấy rằng việc thủy phân cấu trúc cao phân tử của hệ nanoliposome biến tính bằng vật liệu mPEG-Chol cần thời gian lâu hơn so với hệ nanoliposome thơng thường. Vì vậy, sự phóng thích thuốc sau 48 giờ khảo sát của cả hai hệ nanoliposome là khác nhau. Kết quả phóng thích thuốc CAR từ hệ SLP@mPEG-Chol được so sánh với kết quả nghiên cứu của Poy và các cộng sự (2018) khi tiến hành đánh giá độc tính của hệ liposome nang hóa CAR ứng dụng điều trị ung thư phổi [81]. Kết quả nghiên cứu của Poy và các cộng sự cho thấy hệ
liposome mang CAR sau 48 giờ đã phóng thích 15% thuốc. Trong khi đó, thuốc nguyên liệu CAR phóng thích đến 80% sau 48 giờ. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy khả năng phóng thích thuốc chậm hơn cho với thuốc nguyên liệu của hệ liposome biến tính bề mặt bằng mPEG-Chol.
Mơ hình động học phóng thích thuốc:
Các tham số giải phóng động học và hệ số hồi quy được tính tốn từ bốn mơ hình động học phóng thích thuốc in vitro của CAR ngun liệu và CAR được nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol được trình bày trong Bảng 3.10.
Bảng 3.10. Hằng số tốc độ và hệ số tương quan của CAR nguyên liệu, CAR được
nang hóa trong SLP và SLP@mPEG-Chol thu được thơng qua mơ hình động học bậc khơng, mơ hình động học bậc một, mơ hình Higuchi và mơ hình Korsmeyer-Peppas
Mơ hình bậc khơng Mơ hình bậc một Mơ hình Higuchi Mơ hình Korsmeyer- Peppas k0 R2 kf R2 kH R2 kK n R2 CAR 0,3601 0,7761 0,0005 0,5612 8,2091 0,4366 76,436 0,0584 0,9503 CAR/SLP 0,1058 0,2832 0,0009 0,2945 4,1583 0,3450 45,509 0,0414 0,6049 CAR/SLP@ mPEG-Chol 0,0817 0,5541 0,0149 0,9315 2,5845 0,3742 27,083 0,0443 0,8774
Kết quả Bảng 3.10 cho thấy CAR nguyên liệu cho giá trị R2 là 0,7761, 0,5612, 0,4366 và 0,9503 đối với các mơ hình lần lượt là mơ hình động học bậc khơng, mơ hình động học bậc một, mơ hình Higuchi và mơ hình Korsmeyer- Peppas. CAR/SLP cho giá trị R2 là 0,2832, 0,2945, 0,3450 và 0,6049 đối với các mơ hình lần lượt là mơ hình động học bậc khơng, mơ hình động học bậc một, mơ hình Higuchi và mơ hình Korsmeyer-Peppas. Đối với mỗi mơ hình động học tương ứng, dạng phóng thích của CAR ngun liệu và CAR được nang hóa trong SLP đều cho thấy mối tương quan cao nhất với mơ hình Korsmeyer-Peppas (R2 = 0,9503 đối với
CAR và R2 = 0,6049 đối với CAR/SLP,
Hình 3.11.d). Theo mơ hình này, cả CAR và CAR/SLP đều cho sự phóng
thích thuốc tn theo khuếch tán Fickian với giá trị n < 0,45 (n = 0,0584 đối với CAR và n = 0,0414 đối với CAR/SLP) [66]. Sự giảm hằng số kk bởi q trình nang hóa thuốc vào SLP (kk = 76,436 đối với CAR và kk = 45,509 đối với CAR/SLP) cho thấy việc kéo dài phóng thích thuốc CAR khi nang hóa vào hệ nanoliposome.
Trong khi đó, CAR/SLP@mPEG-Chol cho giá trị R2 là 0,5541, 0,9315, 0,3742 và 0,8774 đối với các mơ hình lần lượt là mơ hình động học bậc khơng, mơ hình động học bậc một, mơ hình Higuchi và mơ hình Korsmeyer-Peppas. Kết quả cho thấy dạng phóng thích của CAR được nang hóa trong hệ liposome được biến tính bằng vật liệu mPEG-Chol thể hiện mối tương quan cao nhất với mơ hình bậc
một (