Mẫu sau khi đồng nhất được thực hiện như sau:
(1) Phần mẫu ban đầu đem đi kiểm tra được mô tả trong phần 3.3.2.1, 3.3.2.2 và 3.3.2.3
(2) Phần mẫu còn lại sau khi tăng sinh được giữ lại ủ ở 48h/300C và cấy trên môi trường OXA, kiểm tra đĩa dương tính với Esculin và sau đó được kiểm tra giống như phần 3.3.2.2 và 3.3.2.3.
3.3.2.1. Xử lý mẫu và tăng sinh
Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường BLEB
Cấy một thể tích chính xác vào 15 ống ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 10-1, 10-2, 10-3
Đem ống nghiệm ủ ở 300C/48h
Hình 3.4: Sơ đồ xử lý mẫu và tăng sinh.
Mẫu kiểm tra
Không xử lý
Rửa dưới vòi nước chảy Rửa, ngâm với dung dịch nước muối 0,85% Rửa, ngâm với dung dịch thuốc tím 10ppm Pha loãng mẫu
Thuyết minh: Sau khi đã cân phân tích 25g/mẫu, thêm 225ml BPW và làm dập khoảng 30s trong bao vô trùng, tiến hành tăng sinh như sau:
Chuẩn bị 60 ống (5ml/ống) canh thang chứa môi trường làm giàu BLEB và 8 ống (9ml/ống) nước muối sinh lý đã được vô trùng
Mỗi mẫu 15 ống với 3 nồng độ pha loãng bâc 10 liên tiếp: 10-1, 10-2, 103. Pha loãng bâc 10 liên tiếp bằng cách hút 1ml từ bao chứa mẫu ban đầu cho vào ống nước muối sinh lý đươc 10-2 và từ ống 10-2 hút 1ml cho vào ống nước muối sinh lý được nồng độ 10-3. Cứ mỗi nồng độ hút 1ml cho vào 5 ống nghiệm
Đem đi ủ ở 48h/300C [15]
3.3.2.2. Định danh Listeria monocytogenes từ các ống nghiệm cấy tăng sinh thuộc dãy MPN
Hình 3.5: Sơ đồ định danh Listeria monocytogenes
Thuyết minh: Phát hiện Listeria monocytogenes có trong các ống nghiệm
thuộc dãy MPN. Quá trình định danh như sau:
a. Esculin
Tại thời điểm 48h, cấy ria trên môi trường thạch phân lập OXA chứa esculin. Nuôi cấy trên các đĩa thạch OXA ở 30 380C trong 48h. Theo dõi tại thời điểm 48h ngay sau khi phân lập, các khuẩn lạc Listeria có màu nâu đen với quầng đen trên môi trường chứa esculin. Một số khuẩn lạc màu đen hơi nâu nhưng xuất hiện chậm hơn 2 ngày nhưng không được coi là Listeria.[3][16]
Hinh 3.6: Esculin dương tính (bên trái) - Esculin âm tính (bên phải)
Ủ 30°C/ 48 giờ Ống nghiệm thuộc dãy MPN
Đĩa Thạch OXA
Khuẩn lạc có Esculin (+) Khả năng lên men đường và tan máu
b. Khả năng lên men đường
Sử dụng que cấy kim lấy giống vi sinh vật từ các đĩa dương tính với Esculin, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch hình trụ. Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường Rhamnose, Mantol, Xylose 0,5% ở 300C 24 48h. Kết quả dương tính (môi trường chuyển sang màu vàng) và theo dõi thường xuyên [3][16]
Hình 3.7: Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose. Dương tính (màu vàng) âm tính (màu xanh) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c. Thử catalase
Listeria monocytogenes dương tính.[3]
d. Nhuộm gram
Listeria monocytogenes gram (+) bắt màu tím.[3]
e. Thử khả năng di động theo phương pháp giọt treo
Kiểm tra bằng tiêu bản soi tươi, dùng nước muối sinh lý 0,85% tạo huyền dịch. Chon một khuẩn lạc đủ lớn để làm giọt treo tương đối cao, đánh cho tan đều. Nếu lấy quá ít vi khuẩn, một vài tế bào hiện diện sẽ dán dính trên phiến kính và cho thấy không di động.
Theo dõi trên kính hiển vi, Listeria monocytogenes có hình que ngắn, mảnh, di động quay tròn chậm hoặc theo kiểu nhào lộn do nó có tiêu mao. Đối với, các trực khuẩn lớn hoặc trực khuẩn di chuyển nhanh, kiểu bơi không phải là L. monocytogenes
f. Thử khả năng tan huyết
Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch OXA cấy chuyển sang môi trường thạch máu. Ủ 370C trong 24 28h.Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc
Listeria monocytogenes được bao quanh bởi vòng sáng hẹp do hiện tượng dung
huyết dạng .[3][16].
Hình 3.8: Hình ảnh Listeria monocytogenes trên thạch máu cừu
Nhận xét: Vòng tan máu bê-ta quanh khuẩn lạc do tan tế bào máu, tạo vùng trong, có màu vàng
3.3.2.3. Tra Bảng Mac Crandy
Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sau đó tra bảng Mac Crandy (bảng 4.6) để suy ra mật độ VSV.
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN XÀ LÁCH THEO CÁC CÁCH XỬ LÝ
Đối với sản phẩm rau quả, nhất là xà lách bên cạnh rau phải sạch, hấp dẫn về hình thức (tươi, sạch bụi bẩn, tạp chất), còn yêu cầu an toàn về chất lượng và tiện dụng để tiết kiệm thời gian chế biến [13]. Vì thế đánh giá cảm quan xà lách cũng rất quan trọng bên cạnh việc kiểm tra vi sinh. Trong quá trình nghiên cứu tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở cây rau xà lách, ở mỗi mẫu rau kiểm tra đều có tác động xử lý khác nhau:
A: Đối chứng (không xử lý)
B: Rửa dưới vòi nước chảy
C: Rửa, ngâm bằng dung dịch nước muối 0,85%
D: Rửa, ngâm bằng dung dịch thuốc tím 10 ppm.
4.1.1. Kết quả đánh giá cảm quan về chỉ tiêu màu sắc và trạng thái rau xà lách theo phương pháp cho điểm.
Bảng 4.1 ghi nhận xà lách lại sau 5 ngày bảo quản lạnh (0 - 4oC) như sau :
Bảng 4.1: Rau xà lách sau 5 ngày bảo quản lạnh lạnh (0 - 40C) theo các cách xử lý
Xử lý Quan sát
Không xử lý Bắt đầu có dấu hiệu héo và ngả màu
Rửa dưới vòi nước chảy Giữ được mầu xanh ban đầu
Rửa, ngâm bằng dung dịch nước
muối 0,85% Giữ được mầu xanh ban đầu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Rửa, ngâm bằng dung dịch thuốc
Bảng 4.2: Kết quả đánh giá của cảm quan viên về chỉ tiêu màu sắc và trạng thái của rau xà lách theo phương pháp cho điểm.
Kết quả cho điểm Người thư Mẫu Trật tự trình bày mẫu A B C D 1 ABCD 98119, 47634, 62128, 74824 3 4 5 4 2 ABDC 26316, 69967, 99242, 42293 2 4 4 4 3 ADBC 62781, 39637, 56945, 93661 3 5 5 5 4 DABC 35153, 26837, 71926, 19563 3 4 4 5 5 ACBD 58873, 41611, 12194, 24228 3 5 4 5 6 CABD 17798, 17455, 58857, 11764 2 5 4 4 7 BACD 19452, 57975, 47815, 52523 3 4 4 4 8 ACBD 66834, 25245, 27285, 25299 2 5 5 5 9 ACDB 71782, 88679 34114, 29662 3 4 4 4 10 BDAC 83196, 93516, 32777, 64843 3 4 4 4 11 BCAD 92581, 73375, 35314, 74918 2 4 4 5 12 BDCA 44949, 93188, 85428, 31322 3 5 4 4
4.1.2. Kết luận
Sau khi thử nghiệm cảm quan đối với 4 mẫu trên được bảo quản lạnh (<40C), chỉ có mẫu đối chứng khác biệt nhất so với 3 mẫu đã qua các xử lý khác nhau. Như vậy, qua 3 cách xử lý rửa dưới vòi nước chảy, rửa bằng dung dịch nước muối 0,85% và rửa bằng dung dịch thuốc tím 10 ppm đều không ảnh hưởng tới giá trị cảm quan của xà lách so với mẫu đối chứng [phụ lục 1].
4.2. TÌNH HÌNH NHIỄM Listeria monocytogenes TRÊN RAU XÀ LÁCH 4.2.1. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes tại các vườn rau. 4.2.1. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes tại các vườn rau.
Khảo sát mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên 9 mẫu xà lách thu được ở 3 khu vực: Khu vực phía Bắc thành phố Nha Trang, Khu vực phía Nam thành phố Nha Trang và khu vực huyện Diên Khánh được trình bày trên Bảng 4.3, Hình 4.1.
Bảng 4.3: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở các vùng kiểm tra.
Khu vực Số mẫu kiểm tra Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Trung bình (MPN/g rau)
Phía Bắc thành phố Nha Trang 3 3 100 28,4
Phía Nam thành phố Nha Trang 3 3 100 27,2
Huyện Diên Khánh 3 3 100 4,6 Tổng 9 9 100 20,6 0 20 40 60 80 100 120 Phía Bắc thành phố Nha Trang Phía Nam thành phố Nha Trang Huyện Diên Khánh
Khu vực lấy mẫu
T ỷ lệ n h iễ m ( % ) 0 5 10 15 20 25 30 M ứ c đ ộ n h iễ m ( M P N /g ) Tỷ lệ nhiễm (%) Trung bình (MPN/g)
Hình 4.1: Biểu đồ biểu diễn tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở các vùng kiểm tra
Nhận xét: Qua kết quả trên chúng ta thấy các mẫu kiểm tra đều có nhiễm
Listeria monocytogenes, tỷ lệ nhiễm 100%. Listeria monocytogenes có ở khắp nơi trong
môi trường xung quanh như đất, nước, do vậy tỷ lệ nhiễm cao trên cây rau xà lách là điều dễ chấp nhận. Tùy theo vùng mức độ nhiễm Listeria monocytogenes có khác nhau, từ 4,6 đến 28,4 MPN/g rau, trung bình nhiễm 20,06MPN/g rau. Vùng có mức nhiễm thấp nhất là Diên Khánh (4,6 MPN/g rau).
Mức độ nhiễm lệ thuộc nhiều vào môi trường xung quanh trong đó có nước tưới. Liên hệ giữa nước tưới và mức nhiễm Listeria monocytogenes ở các mẫu được trình bày trong Bảng 4.4
Bảng 4.4: Liên hệ giữa nước tưới và mức nhiễm L. monocytogenes
Khu vực Vườn rau Nhiễm L. monocytogenes (MPN/g) Nước sử dụng tưới rau
Vườn rau Vĩnh Hải 75 Nước ao hồ
Vườn rau Phú Sương 1 3 Nước ngầm
Phía Bắc TP.Nha
Trang Vườn rau Phú Sương 2 7,2 Nước giếng
Vườn rau Phước Hải 75 Nước ao hồ
Vườn rau Phú Thạnh 3,6 Giếng bơm
Phía Nam TP.Nha
Trang Vườn rau Đồng Nai 3 Nước ngầm
Vườn rau Diên Phú 1 3 Giếng bơm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vườn rau Diên Phú 2 3,6 Giếng bơm
Huyện Diên
Nhận xét: Nước tưới tại mỗi vườn rau khác nhau ví dụ như tại vườn rau Vĩnh Hải và Phước Hải (quy mô trồng rau lớn) nhiễm Listeria monocytogenes cao đều lấy nước ao hồ tưới và nước rất đục. Trong khi đó vườn rau Phú Sương và vườn rau Diên Phú (quy mô trồng rau nhỏ) đều có lượng Listeria monocytogenes
thấp và lại là những vườn rau dùng nước ngầm hoặc giếng gia đình.
Phần lớn, xà lách được trồng trên những mảnh vườn, mảnh ruộng quanh nhà với một chế độ tưới bón còn rất lỏng lẻo về mặt vệ sinh nên là nguồn lây lan các bệnh truyền nhiễm đường tiêu hóa nguy hiểm. Một số các loại rau này ưa sống ở những nơi nhiều nước nên thường được trồng ở các ao, hồ, mương máng, ruộng nước, những nơi đất ẩm ven sông, ven suối. Quá trình nhiễm Listeria monocytogenes ở tất cả các công đoạn như trồng trọt, vận chuyện, tưới rau (giữ cho rau tươi khi đã đem ra chợ) cộng với thói quen ăn sống đã gây nhiều căn bệnh nguy hiểm cho con người.
4.2.2. Ảnh hưởng của các quá trình xử lý đến mức nhiễm Listeria monocytogenes
Bên cạnh những món ăn được chế biến từ thịt, trứng, cá… thì việc đưa thêm rau sống vào khẩu phần ăn hàng ngày là rất quan trọng để cung cấp cho cơ thể một lượng vitamin C, E, A, chất khoáng và một số yếu tố vi lượng, cũng như chất xơ cần thiết cho quá trình tiêu hóa.Tuy nhiên, nếu rau sống không được đảm bảo vệ sinh (tưới phân bón tươi, sử dụng thuốc trừ sâu không đúng qui định…) thì lại là món ăn chứa vô số những tác nhân gây bệnh: vi khuẩn, trứng giun sán, ấu trùng giun sán và các loại bào nang amip, trùng lông, trùng roi...
Để bảo đảm vệ sinh, an toàn, rau trước khi sử dụng đều qua rửa, tùy theo từng gia đình, cách xử lý có khác nhau, rửa dưới vòi nước chảy, rửa với nước muối rửa với thuốc tím.
Trong thí nghiệm, chọn nồng độ muối là 0,85% - nước muối sinh lý, và dung dịch thuốc tím 10 ppm. Kết quả được trình bày trong bảng 4.5
Bảng 4.5: Số lượng Listeria monocytogenes trong rau xà lách sau khi đã qua xử lý. Nhiễm L. monocytogenes (MPN/g) sau
các cách xử lý khác nhau Mẫu Không xử lý Rửa dưới vòi nước chảy Rửa, ngâm với nước muối (0,85%) Rửa, ngâm với dung dịch thuốc tím (10ppm)
Vườn rau Vĩnh Hải 75 9,2 7,2 -
Vườn rau Phú Sương 1 3 3 <3 -
Phía Bắc TP.Nha
Trang Vườn rau Phú Sương 2 7,2 3 <3 -
Vườn rau Phước Hải 75 11 7,2 3
Vườn rau Phú Thạnh 3,6 3 3 -
Phía Nam TP.Nha
Trang Vườn rau Đồng Nai 3 3 <3 -
Vườn rau Diên Phú 1 3 3 <3 <3
Vườn rau Diên Phú 2 3,6 3 3 -
Huyện Diên Khánh
Vườn rau Diên Phú 3 7,2 3 3 -
Trung bình 45,15 10,3 5,85 * -
Ghi chú: (-): không phát hiện trong 25 g mẫu; <3: phát hiện có trong 25 g mẫu nhưng số lượng thấp không xác định được. *: trung bình ở 5 mẫu xác định được.
Nhận xét: Rửa dưới vòi nước chảy và rửa, ngâm với nước muối sinh lý làm
giảm được số lượng nhiễm Listeria monocytogenes trên rau xà lách, từ 45,15 xuống còn 10,3 và 5,85 (MPN/g rau) theo thứ tự. Rửa, ngâm với nước muối chỉ
còn 4/9 mẫu có số lượng nhiễm Listeria monocytogenes <3MPN/g rau. Tuy nhiên, hầu hết các mẫu rau vẫn còn nhiễm, do vậy nguy cơ nhiễm cho người tiêu dùng vẫn còn.
Quá trình xử lý có sự thay đổi rõ rệt lượng Listeria monocytogenes đối với các vườn rau có lượng Listeria monocytogenes cao nhưng lại không đáng kể đối với các vườn rau có lượng Listeria monocytogenes thấp, nguyên nhân có thể do lượng Listeria monocytogenes cao thì xác xuất xử lý làm giảm Listeria
monocytogenes cao hơn so với vườn rau xà lách có lượng Listeria monocytogenes (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thấp. So với 2 cách rửa trên, cách rửa có sử dụng thuốc tím 10 ppm cho thấy có hiệu quả hơn nhiều. Số lượng Listeria monocytogenes nhiễm đã giảm rõ rệt so với các mẫu khác và đối chứng, vẫn còn 2/9 mẫu còn nhiễm, đối với người suy giảm miễn dịch vẫn còn là mối nguy khi sử dụng lượng rau nhiều.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 1. Kết luận
Nhìn chung xà lách tại 3 khu vực: Khu vực phía Bắc TP.Nha Trang, khu vực phía Nam TP.Nha Trang và khu vực huyện Diên Khánh đều có nhiễm Listeria
monocytogenes và lượng nhiễm không đồng đều. Mức nhiễm trung bình 45,15 MPN/g
rau
Rửa rau xà lách dưới vòi nước chảy và rửa, ngâm với nước muối sinh lý cho thấy có tác dụng làm giảm lượng Listeria monocytogenes, tuy vậy nguy cơ nhiễm vẫn còn. Trong đó cách rửa có sử dụng thuốc tím 10 ppm cho thấy có hiệu quả hơn nhiều, dù vậy, vẫn còn 2/9 mẫu còn nhiễm Listeria monocytogenes.
Dù nguy cơ nhiễm không cao nhưng Listeria monocytogenes cho thấy là một vi khuẩn nguy hiểm và rất dễ gây tử vong cho người bệnh nếu không phát hiện sớm, nhất là tình trạng ăn uống bừa bãi, thiếu ý thức vệ sinh an toàn thực phẩm như hiện nay. Loài vi khuẩn Listeria monocytogenes này thật sự là mối nguy và cần được mọi người quan tâm, cảnh giác, đặc biệt phụ nữ mang thai và những người có hệ thống miễn dịch kém.Mong rằng ngành chức năng cần có sự giám sát chặt chẽ hơn đối với các cơ sở chế biến thức ăn và đẩy mạnh tuyên truyền giáo dục cộng đồng hơn nữa để phòng ngừa triệt để sự lây nhiễm của loại vi khuẩn nguy hiểm này trong tương lai.
2. Đề xuất ý kiến
Chỉ với thời gian ngắn (chưa đầy 3 tháng) cùng với quá trình kiểm tra Listeria
monocytogenes khá phức tạp và cơ sở vật chất còn hạn chế nên công trình nghiên
cứu còn sơ khai và chưa nói lên được hết mức độ ảnh hưởng của Listeria
monocytogenes trong thực phẩm, nhân đây em có một số đề xuất như sau:
Đánh giá mức độ nhiễm Listeria monocytogenes do ảnh hưởng từ môi trường (phân bón, đất trồng…).
Đánh giá tình hình nhiễm Listeria monocytogenes từ các loại rau sống khác. Tìm biện pháp xử lý rau sống đến mức an toàn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước:
[1]. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1980). Vi sinh vật học, tập 2.Nhà xuất bản Đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội
[2]. Nguyễn Tiến Dũng (2008), Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. Nhà xuất bản Đại học quốc gia tpHCM
[3]. Nguyễn Thị Thanh Hải và cộng sự (2007). Sổ tay phân tích vi sinh thực phẩm. Trường Đại Học Nha Trang
[4]. Nguyễn Đức Hùng và cộng sự (2004),Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản. Nhà sản xuất nông nghiệp Hà Nội.
[5]. Võ Thành Hưng (2009), Luận án Nghiên cứu về Listeria monocytogenes trong các sản phẩm thuỷ sản. Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp.Hồ Chí Minh
[6]. Lại Mai Hương, Phan Ngọc Dung (2006). Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch rửa và điều kiện rửa tới chất lượng của rau salat sơ chế.Tạp chí phát triển KH&CN. Tập 9.Trường Đại Học Bách Khoa, ĐHQG-HCM
[7]. Lê Thị Khánh (2010). Cây rau. Online: http://www.huaf.edu.vn/
[8]. Phạm Hữa Nguyên (2010). Điều tra kỹ thuật trồng rau xà lách. Online: http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/5531383
[9]. Hoàng Phê (1998). Từ Điển tiếng việt Wiktionary. Nhà xuất bản khoa học Hà Nội.
[10].Trần Duy Phong (2009). Các phương pháp định lượng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm - thực tế áp dụng trên thế giới và Việt Nam. Đại Học Bách Khoa Hà Nội
[11]. Hà Duyên Tư (2006). Kỹ thuật phân tích đánh giá cảm quan thực phẩm. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội
[12]. Trần Thanh Thủy (2009), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật hoc, Nhà xuất