2.4.2.1. Phương pháp đếm trực tiếp
Mật độ VSV đơn bào có kích thước lớn như nấm men, men, tảo…có thể được xác định trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hiển vi.
Đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu: Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào
Hình 2.7: Buồng đếm hồng cầu.
+Ưu điểm: Cho biết được số lượng vi sinh vật
+Nhược điểm: Dễ nhầm lẫn, độ chính xác không cao, không thích hợp cho huyền phù có mật độ thấp.
Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang +Các chất nhuộm phát huỳnh quang
- Acridin cam (AODC)
- 4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI) - Fluorescein isothiocyanate (FITC)
+Ưu điểm: Loại bỏ sai số do các chất bẩn. Kết quả phản ánh đúng với sinh khối [4][10] 2.4.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc Ưu điểm: Cho phép xác định số tế bào sống Định lượng chọn lọc vsv Phương pháp:
Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu
Cấy mẫu vào môi trường gồm 2 phương pháp: phương pháp đổ đĩa và phương pháp cấy bề mặt, sau đó ủ mẫu
Đếm số khuẩn lạc hình thành
Hình 2.8: Phương pháp cấy trên đĩa từ các ống tăng sinh
Phương pháp đổ đĩa
Chuẩn bị đĩa petri vô trùng
Môi trường được chuẩn bị hấp khử trùng và được bảo quản mát ở 450 C trong bể điều nhiệt.
Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp). Đổ vào đĩa đã cấy 10 15ml môi trường, lắc đều. Để nguội môi trường.
Đem ủ.
- Ưu điểm: Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml). Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xúc từ nhiều phía. Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng 150 300 khuẩn lạc
- Nhược điểm: Không định lượng được những VSV quá nhạy nhiệt. Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định. Khó làm thuần một dòng VSV.
Phương pháp cấy bề mặt
Môi trường phải được chuẩn bị trên đĩa trước 1 2 ngày để khô mặt Phương pháp:
- Cấy 0,1 0,3ml vào đĩa môi trường. - Trải đều trên mặt bằng que trang tam giác. - Để ở nhiệt độ phòng 15 20 phút cho khô mặt.
- Ưu điểm: Định lượng được các VSV nhạy nhiệt. Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng. Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu.
- Nhược điểm: Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ. Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp.
Đếm khuẩn lạc
Đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường
Thường chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 30 300 Dùng bút để đếm các khuẩn lạc đã đếm
Tính toán kết quả: Dựa trên số khuẩn lạc đếm được và độ pha loãng để tính ra số khuẩn lạc VSV trong dung dịch ban đầu [4] [10]
2.4.2.3. Phương pháp đếm khuẩn lạc trên màng lọc
- Kích thước lỗ lọc 0,47 µm hay 0,22 µm
- Đường kính và hình dạng màng lọc phụ thực vào đường kính phễu lọc - Đường kính màng thường là 45 mm
Phương pháp lọc vi sinh vật
Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọc Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp: <150 khuẩn lạc/màng Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 100ml.
Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng bằng dd pha loãng hay nước cất vô trùng:
- Ưu điểm: Xác định được mật độ VSV cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml, 100ml …
- Nhược điểm: Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn [4] [10].
2.4.2.4. Phương pháp MPN (Most Probable Number)
Listeria monocytogenes tồn tại trong thực phẩm không nhiều như vi khuẩn E.
coli, Salmonella… nên để định lượng chính xác Listeria monocytogenes trong thực
phẩm cụ thể là trong rau xà lách thì phương pháp MPN được áp dụng cho kết quả tối ưu nhất so với các phương pháp trên.
Phương pháp MPN (phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ) là phương pháp dùng để ước lượng số lượng vi sinh vật hiện diện trong một đơn vị thể tích dựa vào bảng Mac Crandy. Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.
Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lập lại nhiều lần (3 10 lần).
Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính.
Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu.
Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN. Có 2 hệ thống MPN:
- Hệ thống 9 ống. - Hệ thống 15 ống. Đặc điểm:
- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như sự tạo hơi: Coliforms…sự đổi màu: S. aureus.
- Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn.
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm tra trong ống nghiệm để xác định ống dương tính. Tra bảng Mac Crandy để có kết quả ( bảng 4.6) [4] [10].
CHƯƠNG III: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Listeria monocytogene nhiễm từ rau xà lách lấy tại các vườn rau thuộc khu
vực Phía Bắc thành phố Nha Trang, Phía Nam thành phố Nha Trang và khu vực huyện Diên Khánh.
Hình 3.1: Bản đồ mô tả khu vực lấy mẫu
Ghi chú:
3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1. Xà Lách 3.2.1. Xà Lách
Xà lách (5 7 cây) sau khi lấy tại vườn rau được đưa ngay về phòng thí nghiệm và tiến hành tách từng lá và trọn đều, chia đều 4 mẫu: (mỗi mẫu cắt nhỏ và cân 25g/mẫu).
Mẫu 1: Không xử lý ( đối chứng )
Mẫu 2: Rửa kỹ dưới vòi nước chảy, tránh làm trầy, dập lá. Mẫu 3: Rửa, ngâm dung dịch trong nước muối 0,85%. Mẫu 4: Rửa, ngâm trong dung dịch thuốc tím 10 ppm.
(1) Phía Bắc thành phố Nha Trang (2) Phía Nam thành phố Nha Trang (3) Khu vực huyện Diên Khánh
1
2 3
3.2.2. Các loại hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (1100C/30 phút hoặc 1210C/15 phút). Các dụng cụ như pipet, ống đong được sấy 1800C/30’. Đĩa peptri nhựa dùng dung dịch khử trùng 0.2% và để ráo trước khi đổ đĩa [12].
3.2.2.1. Hóa chất
Nước Pepton 0,1 %.
Muối Nacl, Na2HPO4 và KH2PO4. Thạch Oxford Agar.
Môi trường tăng sinh BLEB.
Thạch máu cừu.
Môi trường test đường gồm: Môi trường cơ bản, agar 1% và canh thang đường Rhamnose, Xylose, Mantose 0,5%.
Bộ thuốc nhuộm Gram. Hydrogen Peroxide 3%
Môi trường giữ chủng: Môi trường lỏng BLEB, 0,6% cao nấm men, 1,5% agar.
3.2.2.2. Máy móc, dụng cụ
Ống đong (100ml, 250ml,500ml, 1000ml), bình tam giác, pipet, đĩa peptri, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm các loại.
Tủ sấy, máy hấp vô trùng cùng các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm Hóa - Vi sinh thuộc khoa chế biến trường Đại Học Nha Trang.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các phương pháp xử lý đến sự biến đổi bên ngoài của cây rau.
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình kiểm tra Listeria monocytogenes
Xà lách
Không xử lý Rửa dưới vòi nước chảy Ngâm rửa với nước muối 0,85% Ngâm rửa với thuốc tím10ppm Kiểm tra và đánh giá Để nhẹ nhàng mỗi mẫu vào túi ni lông
Bảo quản lạnh (0-40C)
Mẫu lấy về
Xử lý mẫu
Cân 25g rau/225ml BPW
Ủ 48h/ 300C Cấy trên dãy MPN
Cấy ria trên môi
trường OXA Ghi nhận ống (+) với Listeria monocytogenes Tra bảng Mac Crandy -Tan máu -Manitol (-) -Rhamnose (+) -Xylose (-) Đồng nhất (2) Esculin (+) (1) Test định danh
3.3.2. Quy Trình Thực hiện
Mẫu sau khi đồng nhất được thực hiện như sau:
(1) Phần mẫu ban đầu đem đi kiểm tra được mô tả trong phần 3.3.2.1, 3.3.2.2 và 3.3.2.3
(2) Phần mẫu còn lại sau khi tăng sinh được giữ lại ủ ở 48h/300C và cấy trên môi trường OXA, kiểm tra đĩa dương tính với Esculin và sau đó được kiểm tra giống như phần 3.3.2.2 và 3.3.2.3.
3.3.2.1. Xử lý mẫu và tăng sinh
Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường BLEB
Cấy một thể tích chính xác vào 15 ống ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 10-1, 10-2, 10-3
Đem ống nghiệm ủ ở 300C/48h
Hình 3.4: Sơ đồ xử lý mẫu và tăng sinh.
Mẫu kiểm tra
Không xử lý
Rửa dưới vòi nước chảy Rửa, ngâm với dung dịch nước muối 0,85% Rửa, ngâm với dung dịch thuốc tím 10ppm Pha loãng mẫu
Thuyết minh: Sau khi đã cân phân tích 25g/mẫu, thêm 225ml BPW và làm dập khoảng 30s trong bao vô trùng, tiến hành tăng sinh như sau:
Chuẩn bị 60 ống (5ml/ống) canh thang chứa môi trường làm giàu BLEB và 8 ống (9ml/ống) nước muối sinh lý đã được vô trùng
Mỗi mẫu 15 ống với 3 nồng độ pha loãng bâc 10 liên tiếp: 10-1, 10-2, 103. Pha loãng bâc 10 liên tiếp bằng cách hút 1ml từ bao chứa mẫu ban đầu cho vào ống nước muối sinh lý đươc 10-2 và từ ống 10-2 hút 1ml cho vào ống nước muối sinh lý được nồng độ 10-3. Cứ mỗi nồng độ hút 1ml cho vào 5 ống nghiệm
Đem đi ủ ở 48h/300C [15]
3.3.2.2. Định danh Listeria monocytogenes từ các ống nghiệm cấy tăng sinh thuộc dãy MPN
Hình 3.5: Sơ đồ định danh Listeria monocytogenes
Thuyết minh: Phát hiện Listeria monocytogenes có trong các ống nghiệm
thuộc dãy MPN. Quá trình định danh như sau:
a. Esculin
Tại thời điểm 48h, cấy ria trên môi trường thạch phân lập OXA chứa esculin. Nuôi cấy trên các đĩa thạch OXA ở 30 380C trong 48h. Theo dõi tại thời điểm 48h ngay sau khi phân lập, các khuẩn lạc Listeria có màu nâu đen với quầng đen trên môi trường chứa esculin. Một số khuẩn lạc màu đen hơi nâu nhưng xuất hiện chậm hơn 2 ngày nhưng không được coi là Listeria.[3][16]
Hinh 3.6: Esculin dương tính (bên trái) - Esculin âm tính (bên phải)
Ủ 30°C/ 48 giờ Ống nghiệm thuộc dãy MPN
Đĩa Thạch OXA
Khuẩn lạc có Esculin (+) Khả năng lên men đường và tan máu
b. Khả năng lên men đường
Sử dụng que cấy kim lấy giống vi sinh vật từ các đĩa dương tính với Esculin, dùng que cấy đâm sâu vào khối thạch hình trụ. Ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường Rhamnose, Mantol, Xylose 0,5% ở 300C 24 48h. Kết quả dương tính (môi trường chuyển sang màu vàng) và theo dõi thường xuyên [3][16]
Hình 3.7: Các ống nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường Rhamnose. Dương tính (màu vàng) âm tính (màu xanh)
c. Thử catalase
Listeria monocytogenes dương tính.[3]
d. Nhuộm gram
Listeria monocytogenes gram (+) bắt màu tím.[3]
e. Thử khả năng di động theo phương pháp giọt treo
Kiểm tra bằng tiêu bản soi tươi, dùng nước muối sinh lý 0,85% tạo huyền dịch. Chon một khuẩn lạc đủ lớn để làm giọt treo tương đối cao, đánh cho tan đều. Nếu lấy quá ít vi khuẩn, một vài tế bào hiện diện sẽ dán dính trên phiến kính và cho thấy không di động.
Theo dõi trên kính hiển vi, Listeria monocytogenes có hình que ngắn, mảnh, di động quay tròn chậm hoặc theo kiểu nhào lộn do nó có tiêu mao. Đối với, các trực khuẩn lớn hoặc trực khuẩn di chuyển nhanh, kiểu bơi không phải là L. monocytogenes
f. Thử khả năng tan huyết
Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch OXA cấy chuyển sang môi trường thạch máu. Ủ 370C trong 24 28h.Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc
Listeria monocytogenes được bao quanh bởi vòng sáng hẹp do hiện tượng dung
huyết dạng .[3][16].
Hình 3.8: Hình ảnh Listeria monocytogenes trên thạch máu cừu
Nhận xét: Vòng tan máu bê-ta quanh khuẩn lạc do tan tế bào máu, tạo vùng trong, có màu vàng
3.3.2.3. Tra Bảng Mac Crandy
Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sau đó tra bảng Mac Crandy (bảng 4.6) để suy ra mật độ VSV.
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN XÀ LÁCH THEO CÁC CÁCH XỬ LÝ
Đối với sản phẩm rau quả, nhất là xà lách bên cạnh rau phải sạch, hấp dẫn về hình thức (tươi, sạch bụi bẩn, tạp chất), còn yêu cầu an toàn về chất lượng và tiện dụng để tiết kiệm thời gian chế biến [13]. Vì thế đánh giá cảm quan xà lách cũng rất quan trọng bên cạnh việc kiểm tra vi sinh. Trong quá trình nghiên cứu tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở cây rau xà lách, ở mỗi mẫu rau kiểm tra đều có tác động xử lý khác nhau:
A: Đối chứng (không xử lý)
B: Rửa dưới vòi nước chảy
C: Rửa, ngâm bằng dung dịch nước muối 0,85%
D: Rửa, ngâm bằng dung dịch thuốc tím 10 ppm.
4.1.1. Kết quả đánh giá cảm quan về chỉ tiêu màu sắc và trạng thái rau xà lách theo phương pháp cho điểm.
Bảng 4.1 ghi nhận xà lách lại sau 5 ngày bảo quản lạnh (0 - 4oC) như sau :
Bảng 4.1: Rau xà lách sau 5 ngày bảo quản lạnh lạnh (0 - 40C) theo các cách xử lý
Xử lý Quan sát
Không xử lý Bắt đầu có dấu hiệu héo và ngả màu
Rửa dưới vòi nước chảy Giữ được mầu xanh ban đầu
Rửa, ngâm bằng dung dịch nước
muối 0,85% Giữ được mầu xanh ban đầu
Rửa, ngâm bằng dung dịch thuốc
Bảng 4.2: Kết quả đánh giá của cảm quan viên về chỉ tiêu màu sắc và trạng thái của rau xà lách theo phương pháp cho điểm.
Kết quả cho điểm Người thư Mẫu Trật tự trình bày mẫu A B C D 1 ABCD 98119, 47634, 62128, 74824 3 4 5 4 2 ABDC 26316, 69967, 99242, 42293 2 4 4 4 3 ADBC 62781, 39637, 56945, 93661 3 5 5 5 4 DABC 35153, 26837, 71926, 19563 3 4 4 5 5 ACBD 58873, 41611, 12194, 24228 3 5 4 5 6 CABD 17798, 17455, 58857, 11764 2 5 4 4 7 BACD 19452, 57975, 47815, 52523 3 4 4 4 8 ACBD 66834, 25245, 27285, 25299 2 5 5 5 9 ACDB 71782, 88679 34114, 29662 3 4 4 4 10 BDAC 83196, 93516, 32777, 64843 3 4 4 4 11 BCAD 92581, 73375, 35314, 74918 2 4 4 5 12 BDCA 44949, 93188, 85428, 31322 3 5 4 4
4.1.2. Kết luận
Sau khi thử nghiệm cảm quan đối với 4 mẫu trên được bảo quản lạnh (<40C), chỉ có mẫu đối chứng khác biệt nhất so với 3 mẫu đã qua các xử lý khác nhau. Như vậy, qua 3 cách xử lý rửa dưới vòi nước chảy, rửa bằng dung dịch nước muối 0,85% và rửa bằng dung dịch thuốc tím 10 ppm đều không ảnh hưởng tới giá trị cảm quan của xà lách so với mẫu đối chứng [phụ lục 1].
4.2. TÌNH HÌNH NHIỄM Listeria monocytogenes TRÊN RAU XÀ LÁCH 4.2.1. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes tại các vườn rau. 4.2.1. Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes tại các vườn rau.
Khảo sát mức độ nhiễm Listeria monocytogenes trên 9 mẫu xà lách thu được ở 3 khu vực: Khu vực phía Bắc thành phố Nha Trang, Khu vực phía Nam thành phố Nha Trang và khu vực huyện Diên Khánh được trình bày trên Bảng 4.3, Hình 4.1.
Bảng 4.3: Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở các vùng kiểm tra.
Khu vực Số mẫu kiểm tra Số mẫu nhiễm Tỷ lệ nhiễm (%) Trung bình (MPN/g rau)
Phía Bắc thành phố Nha Trang 3 3 100 28,4
Phía Nam thành phố Nha Trang 3 3 100 27,2
Huyện Diên Khánh 3 3 100 4,6 Tổng 9 9 100 20,6 0 20 40 60 80 100 120 Phía Bắc thành phố Nha Trang Phía Nam thành phố Nha Trang Huyện Diên Khánh
Khu vực lấy mẫu
T ỷ lệ n h iễ m ( % ) 0 5 10 15 20 25 30 M ứ c đ ộ n h iễ m ( M P N /g ) Tỷ lệ nhiễm (%) Trung bình (MPN/g)
Hình 4.1: Biểu đồ biểu diễn tình hình nhiễm Listeria monocytogenes ở các vùng kiểm tra
Nhận xét: Qua kết quả trên chúng ta thấy các mẫu kiểm tra đều có nhiễm
Listeria monocytogenes, tỷ lệ nhiễm 100%. Listeria monocytogenes có ở khắp nơi trong
môi trường xung quanh như đất, nước, do vậy tỷ lệ nhiễm cao trên cây rau xà lách là điều dễ chấp nhận. Tùy theo vùng mức độ nhiễm Listeria monocytogenes có khác nhau,