Mục đích:
Lưu giữ chủng giống để sử dụng trong thời gian dài từ 3-6 tháng.
Tiến hành bảo quản:
- Nuôi cấy vi khuẩn trong các bình tam giác chứa môi trường lỏng.
- Dựa theo đường cong sinh trưởng để xác định đúng thời điểm vi khuẩn sinh
trưởng mạnh nhất.
- Hút lấy 1,5 ml dịch môi trường nuôi cấy cho vào ống eppendorf sau đó thêm
vào glycerol theo tỉ lệ 7: 3.
- Vortex nhẹ cho đều hỗn hợp, rồi đem bảo quản ở -80OC.
2.3.6. Nuôi cấy tạo màng BC
- Khi đã xác định được chủng giống cần tìm thì tiến hành nhân giống trên môi trường nước dừa để nuôi tạo màng.
- Lên men bề mặt trên các khay nhựa có kích thước 20 x 30.
- Các khay được rửa sạch, tráng qua nước sôi và phun cồn để khử trùng - Môi trường lên men có các thành phần sau:
• Nước dừa già : 1000ml
• Đường saccharose : 20 g (2%)
• (NH4)2SO4 : 8 g (0,8%)
• (NH4)2HPO4 : 2 g (0,2%)
• Acetic acid : 12 ml (1,2%)
- Các thành phần trên (trừ acetic acid ) được cho vào nước dừa già đã được lọc sạch.
- Nấu sôi, để nguội khoảng 40oC, bổ sung acetic acid vào.
- Cấy giống vào và trộn đều, lượng giống bổ sung vào phải chiếm tỷ lệ 10% .
- Sau đó phân vào các khay nhựa và đậy kín bằng giấy báo sạch rồi xếp chống
Hình 2.2. Các bước tiến hành nuôi tạo màng BC
2.3.7. Thu nhận và xử lí màng BC
- Sau 7 ngày lên men, màng BC được hình thành.
- Tiến hành lấy màng ra khỏi môi trường nuôi cấy.
- Sau khi thu sinh khối tiến hành rửa bằng nước lạnh 2-3 lần rồi ngâm trong dung
dịch Na2CO3 5% trong 10 phút để trung hoà acetic acid còn sót bên trong. - Sau đó rửa lại bằng nước vài lần.
- Tiến hành sấy khô ở 90oC.
- Màng sau khi sấy khô sẽ tiến hành tẩy màu và mùi bằng dung dịch NaOCl 10% ± 2.
- Thời gian ngâm trong dung dịch NaClO 10% từ 20-30 phút. - Sau đó rửa lại bằng nước và sấy khô. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập vi khuẩn A. xylinum
Sau nhiều lần tiến hành phân lập vi khuẩn từ váng trắng của nước dừa để lên men tự nhiên 3 ngày, chúng trôi đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn nhưng qua quá trình chọn lọc sơ bộ đã giữ lại 3 chủng có mật độ xuất hiện nhiều và có hình thái khuẩn lạc gần giống với vi khuẩn A. xylinum. (bảng 8)
Dựa vào khóa phân loại của Bergey và các nghiên cứu của Frateur (1950),
Nguyễn Thúy Hương (2009) khi mô tả hình thái vi khuẩn A. xylinum ta cần chọn
lọc chủng có đặc điểm như sau: tế bào hình que, Gram âm, hình thái khuẩn lạc tròn, rìa mép nhẵn, trơn bóng, trắng đục.
Từ kết quả của bảng 8 cho thấy trong số 3 chủng vi khuẩn phân lập được thì
chủng A3 có các đặc điểm gần giống nhất.
Bảng 8. Mật độ và hình thái khuẩn lạc phân lập trên môi trường HS STT Tên chủng Mật độ tế bào
(CFU/g) Hình thái khuẩn lạc
1 A1 0,3.103
Khuẩn lạc tròn, trắng đục, bề mặt nhăn, rìa mép răng cưa, kích thước khuẩn lạc
sau 48 giờ từ 2-3,5mm
2 A2 0,5.103
Khuẩn lạc tròn, rìa mép nhẵn, trắng trong, kích thước sau 48 giờ từ 0,5-1,5mm
3 A3 1,2.103
Khuẩn lạc tròn, rìa mép nhẵn, trơn bóng, trắng đục, kích thước khuẩn lạc sau 48 giờ
từ 1,5-2mm
Mật độ của vi khuẩn A3 khá cao trong môi trường nước dừa lên men tự nhiên. Do vậy, chúng tôi chọn chủng A3 tiếp tục nuôi cấy để quan sát hình thái tế bào, thực hiện các
thử nghiệm sinh hóa như: phản ứng catalase, khả năng chuyển hóa glucose, khả năng chuyển hóa ecthanol, và nuôi tạo màng thử nghiệm.
Hình 3.1. Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn A3 sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường HS ở điều kiện pH= 5, nhiệt độ 28oC-32oC
3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn A. xylinum
Chủng A3 được nuôi cấy trên môi trường HS và nhuộm Gram sau 48 giờ nuôi cấy.
Kết thúc quá trình nhuộm Gram, khi quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính dầu 100X chúng tôi thấy vi khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm Fuchsin. Như vậy đây là vi khuẩn Gram (-).
Do thành tế bào vi khuẩn Gram (+) có lớp peptidoglycan dày (phức chất của protein và polysaccharide) và chúng liên kết chặt chẽ với nhau làm giảm tác động
của chất tẩy màu (cồn 96o) do đó sẽ giữ được màu tím của violet sau lần nhuộm đầu
tiên.
Còn đối với vi khuẩn Gram (-), ngoài lớp peptidoglycan mỏng còn lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipodpolysaccharide (gồm lipoprotein và lipopolysaccharide) có bản chất là lipid nên để bị rửa trôi làm mất màu tím violet
khi bị rửa bằng cồn 96o. Sau đó khi nhuộm lại bằng thuốc nhuộm Fuchsin thì sẽ bắt
Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A3 sau khi nhuộm Gram (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(Tế bào hình que, không di động, bắt màu hồng thuốc nhuộm Fuchsin, được quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100X )
3.3. Xác định khả năng sinh trưởng
Chủng vi khuẩn A3 sau khi xác định đăc điểm hình thái thì được nuôi cấy tĩnh trong môi trường HS lỏng có pH= 5,5 và đặt trong nhiệt độ phòng từ 28oC-
32oC nhằm đo khả năng sinh trưởng (hình 3.3).
0.278 0.014 0.033 0.074 0.293 0.311 0.308 0.195 0.156 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Thi gian (ngày)
M t đ t b à o ( O D 6 0 0 ) A3
Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn A3 trên môi trường HS lỏng, pH= 5 và nhiệt độ từ 28oC- 32oC
Sau thời gian 9 ngày nuôi cấy, vi khuẩn A3 sinh trưởng và phát triển hình thành nên đường cong sinh trưởng với 4 pha sinh trưởng gồm: pha lag, pha log, pha cân bằng và pha suy vong. Dựa vào đường cong sinh trưởng dễ dàng nhận thấy, mật độ tế bào ban đầu khi bổ sung vào rất thấp (OD600=0,014) do mới chuyển từ môi trường thạch sang môi trường lỏng nên vi khuẩn cần có thời gian thích nghi, sản sinh ra các loại enzyme cần thiết để phân giải các chất trong môi trường. Vì vậy nên sự sinh trưởng và phát triển còn rất chậm.
Trong 2 ngày tiếp theo mật độ tế bào bắt đầu tăng chậm, cụ thể các giá trị
OD600 = 0,033 vào ngày thứ 2 và tăng dần lên OD600= 0,074 vào ngày thứ 3. Đây là
pha lag của quá trình sinh trưởng. Ở giai đoạn này có thể quan sát thấy huyền phù tế bào trong dịch nuôi cấy nhưng không rõ ràng do số lượng tế bào còn khá ít.
Kết thúc giai đoạn này, vi khuẩn bắt đầu gia tăng nhanh chóng về số lượng do đã hoàn toàn thích nghi với môi trường và các hoạt chất enzyme để phân giải các chất dinh dưỡng đã được tạo ra nhiều để đáp ứng nhu cầu sinh trưởng và phát triển.
Sự tăng đột biến của giá trị OD từ OD600= 0,074 lên OD600= 0,293 trong ngày thứ 4
đã thể hiện sự gia tăng nhanh về số lượng tế bào trong môi trường nuôi cấy. Đây là thời điểm huyền phù tế bào quan sát rõ nhất, các mảng cellulose nhỏ dần hình thành và nối lại với nhau.
Trong 72 giờ tiếp theo, mật độ tế bào vi khuẩn bước vào giai đoạn cân bằng thể hiện qua sự ít biến đổi của giá trị OD trong ngày thứ 5 (OD600= 0,311),thứ 6 (OD600= 0,308), ngày thứ 7 (OD600= 0.278). Trong đó ngày thứ 5 có giá trị OD600=0,311 là giá trị cao nhất, điều đó cho thấy suốt thời gian sinh trưởng (7 ngày) thì ở ngày thứ 5, vi khuẩn gia tăng cực đại về số lượng. Đây cũng là thời điểm màng cellulose hình thành rõ ràng.
Sau thời gian tăng trưởng ổn định, mật độ vi khuẩn bắt đầu giảm do nguồn dinh dưỡng trong môi trường bắt đầu cạn. Lúc này cũng là thời điểm màng cellulose đã hình thành đầy đủ, dịch môi trường nuôi cấy cũng cạn dần. Vi khuẩn bước vào
giai đoạn suy vong, các giá trị OD giảm dần, từ OD600= 0.278 của ngày thứ 7 giảm
nhanh xuống OD600=0.195 vào ngày thứ 8 và OD600=0.156 vào ngày thứ 9. Đây cũng là lúc kết thúc quá trình hình thành màng cellulose. Dựa vào đường cong sinh
trưởng có thể xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn A3 đạt tốc độ cao nhất vào ngày thứ 5. Do vậy chúng tôi chọn thời điểm ngày thứ 5 để tiến hành giữ chủng và ngày thứ 7 để thu màng.
3.4. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylinum
a. Phản ứng catalase
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm phản ứng catalase đối với vi khuẩn A3 sau
thời gian 48 giờ nuôi cấy trên đĩa thạch bang cách dùng que cấy ria lấy một ít khuẩn
lạc đưa lên lam kính, nhỏ dung dịch H2O2 lên và quan sát hiện tượng. Kết quả phản
ứng thể hiện qua hình 3.4
Hình 3.4. Phản ứng catalase của vi khuẩnA3
Khi nhỏ H2O2 lên lam kính có khuẩn lạc của vi khuẩn A3 thì có có hiện
tương sủi bọt khí. Điều đó chứng tỏ vi khuẩn A3 sản sinh enzyme catalase để phân
giải H2O2. Đây cũng là một đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. Xylinum. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
b. Khả năng chuyển hóa ethanol thành acetic acid
Để kiểm tra khả năng chuyển hóa ethanol thành acetic acid, chúng tôi tiến
hành cấy thử nghiệm vi khuẩn A3 trên môi trường có chứa ethanol và CaCO3.
Sau 3 ngày nuôi cấy, chúng tôi quan sát thấy có xuất hiện vòng trắng
trong xung quanh khuẩn lạc của chủng A3 (hình 3.5a). Sau 5 ngày vòng trắng trong
Hình 3.5. Vòng sáng quanh khuẩn lạc A3 sau thời gian nuôi cấy
Hiện tượng trên là do các chủng vi khuẩn Acetobacter lúc đầu chuyển hóa
ethanol thành acetic acid và phân giải CaCO3 tạo thành (CH3COO)2Ca (vòng sáng
trong). Sau đó (CH3COO)2Ca tạo ra bị oxy hóa tiếp chuyển thành CaCO3 làm cho
vòng trong chuyển màu trắng sữa.
c. Khả năng chuyển hóa glucose thành acetic acid
Đối với A. xylinum, việc lên men đi liền với sự hình thành các dicacboxylic
acid không bay hơi (malic acid, fumaric acid, succinic acid), các keto acid (oxaloacetic acid, pyruvic accid) như là các sản phẩm trung gian và các mono carboxylic acid bay hơi (propionic acid, acetic acid, đôi khi cả formic acid) như là các sản phẩm cuối cùng.
Trong môi trường cơ bản có chứa glucose sau 3 ngày nuôi cấy chủng A3 đã
chuyển từ màu xanh lam sang màu vàng. Nguyên nhân là do sự sản sinh các loại acid hữu cơ (phần lớn là acetic acid) làm giảm pH của môi trường xuống dưới 6,8 và làm biến đổi màu của chất chỉ thị (hình 3.6).
Hình 3.6. Khả năng chuyển hóa glucose thành acetic acid của chủng A3
Ống 1 là ống đối chứng chỉ chứa môi trường cơ bản (màu xanh lam)
Ống 2 và 3 là ống có cấy vi khuẩn A3 (màu vàng)
Từ các kết quả kiểm tra khả năng sinh hóa trên, chúng tôi kết luận chủng A3
có các đặc điểm hình thái vài sinh học giống chủng vi khuẩn A. xylinum. Vì vậy chúng tôi tiếp tục tiến hành nuôi cấy để khảo sát khả năng tạo màng BC của chủng A3 để đi đến kết luận cuối cùng.
3.5. Khảo sát khả năng tạo màng cellulose của vi khuẩn A3
a. Kết quả thử nghiệm khả năng tạo màng của A3
Để kiểm tra khả năng tạo màng của vi khuẩn A3, chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trường nước dừa già và các chất dinh dưỡng cần thiết trong thời gian 9 ngày.
Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm khả năng tạo màng của chủng A3trong 9 ngày (theo thứ tự từ hình 1- hình 9)
Quá trình nuôi cấy thử nghiệm tiến hành trong thời gian 9 ngày và sự hình thành của màng BC cũng được quan sát rất rõ thông qua sự thay đổi của mỗi ngày nuôi cấy từ ngày 1 đến ngày 8.
Môi trường bắt đầu chuyển màu đục từ ngày thứ 3, chúng ta quan sát thấy được huyền phù tế bào, các mảng nhỏ của màng cellulose cũng dần hình thành.
Đến ngày thứ 4 thì màng bắt đầu hiện rõ và nhanh chóng dày lên vào ngày thứ 5, thứ 6 và thứ 7. Đến ngày thứ 8 thì dung dịch trong bình nuôi cũng cạn đồng thời màng BC đã đạt kích thước tối đa.
Có sự thay đổi pH trong suốt quá trình nuôi cấy. Đó là do quá trình phát triển của vi khuẩn tạo ra các acid hữu cơ, các hợp chất trung gian. Các acid này làm giảm pH môi trường nhưng sự thay đổi này không đáng kể.(bảng 9)
Bảng 9. Sự thay đổi của pH trong suốt qua trình nuôi cấy
Ngày 1 2 3 4 5 6 7 8 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
pH 5 4 4 3,5 3 3,5 4 4
b.Khảo sát hàm lượng nước dừa nuôi cấy A3
Cũng trong quá trình khảo sát khả năng tạo màng của vi khuẩn A3, chúng tôi
đã tiến hành khảo sát hàm lượng nước dừa cần cho quá trình nuôi cấy. Do đây là nguồn dinh dưỡng chính mà vi khuẩn sử dụng trong quá trình sinh trưởng nên hàm lượng nước dừa rất quan trọng. Nhưng nguồn nguyên liệu này rất hạn chế và phân bố không đồng đều ở các vùng.
Chính vì vậy trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành khảo sát hàm lượng nước dừa cần dùng trong nuôi tạo màng BC nhằm mục đích tìm ra tỉ lệ nước dừa bổ sung phù hợp để giảm chi phí sản xuất. Kết quả khảo sát thể hiện trong bảng 10.
Trên cùng một thể tích dung dịch nuôi cấy là 100 ml, hàm lượng các chất bổ sung như nhau, trong thời gian 7 ngày và cùng các điều kiện về nhiệt độ và pH ( pH= 5, nhiệt độ 28oC-32oC )
Bảng 10. Khảo sát tỉ lệ nước dừa trong nuôi cấy BC Tỉ lệ
nước dừa/dịch nuôi (%)
Thời gian hình thành màng (ngày) Độ dày màng BC sau 7 ngày (mm) 0 6 Rất mỏng, dễ vỡ 10 4 Mỏng 20 4 8 30 3 18 40 3 20 50 2 20
Từ kết quả của bảng 10, chúng tôi nhận thấy ở các hàm lượng từ 0% - 20% khả năng tạo màng rất thấp, mảng mỏng, dễ vỡ ( 0% và 10%). Nhưng đối với hàm lượng nước dừa từ 30% trở lên, màng BC được tạo thành trong thời gian ngắn và hiệu quả cao.
So sánh giữa tỷ lệ 30% và 50% nước dừa qua thời gian hình thành màng và độ dày của màng, chúng tôi nhận thấy hàm lượng nước dừa giảm đi rất nhiều so với cách nuôi truyền thống (sử dụng 100% nước dừa để nuôi cấy màng BC). Nhưng thời gian hình thành màng chỉ chênh lệch 24 giờ (ở tỉ lệ 30% là 3 ngày, tỉ lệ 50% là 2 ngày, so với truyền thống là 2 ngày) và độ dày cũng thay đổi không đáng kể (18 mm và 20 mm). Vì vậy chỉ với việc bổ sung 30% lượng nước dừa vào môi trường nuôi cấy thì vẫn có thể nuôi tạo màng thành công mà chi phí sẽ giảm đi nhiều, rất có lợi cho quá trình sản xuất đại trà (hình 3.7).
c. Các đặc điểm của màng BC sau nuôi cấy
Màng BC sau khi nuôi cấy và xử lý sẽ khác nhau sau mỗi giai đoạn. Cả về độ dày, kích thước, màu sắc và mùi. Các đặc điểm thay đổi đó được miêu tả cụ thể qua bảng 11 bên dưới. Bảng 11. Các đặc điểm của màng BC Loại màng Độ dày (mm) Trọnglượng (g) Kích thước (cm2) Màu sắc Mùi Màng BC tươi 150 420 30 x 20 Trắng đục, hơi vàng Mùi chua Màng BC thô
(chưa xử lí) 0,8 19,24 25 x 15 Nâu vàng Mùi chua
Màng BC hoàn thiện (xử lý bằng
NaOCl 10%)
0,2 7,12 23 x 14 Trắng vàng Không
mùi
d. Khảo sát sơ bộ tính chịu lực của màng BC
Khả năng chịu lực của màng BC là nhân tố có ý nghĩa quan trọng. Vì vậy, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát khả năng chịu lực màng BC sau khi đã xử lý và đem so sánh với màng BC chưa qua xử lý để có thể đánh giá được khả năng ứng dụng của màng. Kết quả khảo sát thể hiện qua bảng 12.
Bảng 12. Khảo sát khả năng chịu lực của màng BC
Loại màng Kích thước (cm x cm) Khả năng chịu lực (N/cm2)
Màng D1 20 x 10 >10000 g/cm2
Màng D2 20 x 10 5261 g/cm2
Màng D3 20 x 10 3155 g/cm2
(Kết quả khảo sát thực hiện tại Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang)
Trong đó: