2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn A. xylinum được phân lập từ môi trường nước dừa lên men tự nhiên
có váng trắng. Sau đó vi khuẩn được giữ trong môi trường thạch nghiêng.
2.1.2. Hóa chất
a. Môi trường phân lập và giữ giống Herstrin và Schram (HS)
Thành phần các chất trong 1 lít: Glucose : 50 g Cao nấm men : 5 g Peptone : 5 g Na2HPO4 : 3 g MgSO4.7H2O : 0,5 g Acid citric : 1,5 g H2O : 1 l Điều chỉnh pH = 5-5,5 bằng HCl 0,5M Agar : 15 g Ethanol : 10 ml Cách pha:
- Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác. - Hấp ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
- Các bình môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh nhiễm tạp và thay đổi pH.
b. Thuốc nhuộm
Thành phần các chất trong 100 ml:
Tím violet : 1 g
Rượu ethylic : 1 g
Phenol tinh thể : 2g
Nước cất : 100 ml
Cách pha:
- Hòa tan 1 g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1) - Hòa tan 2 g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)
- Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet.
Thuốc nhuộm Liugol
Iod tinh thể : 1 g
KI : 2 g
Nước cất : 200 ml
Cách pha:
- Hòa tan iod vào nước cất, sau đó cho KI vào, bảo quản trong lọ tối màu.
Thuốc nhuộm Fuchsin
Fuchsin kiềm : 1g
Rượu ethylic 95% : 10 ml
Phenol tinh thể : 5 g
Nước cất : 100 ml
Cách pha:
- Hòa tan Fuchsin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1). - Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2).
- Trộn đều dung dịch 1 và dung dịch 2 đem lọc thì được thuốc nhuộm Fuchsin.
c. Môi trường thử nghiệm hóa sinh
Môi trường kiểm tra khả năng oxy hóa ethanol
Thành phần các chất trong 1 lít:
Nước cất : 1000 ml Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%: 20 ml. pH = 6,8-7,0 CaCO3 : 10 g Agar : 20 g Ethanol : 20 ml Cách pha:
- Đun sôi môi trường trong bình tam giác ở 100oC trong lò vi sóng cho đến
khi tan hoàn toàn các thành phần môi trường. - Hấp ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
- Các bình môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bị nhiểm tạp.
Môi trường cơ bản kiểm tra khả năng chuyển hóa glucose thành acid
Thành phần các chất trong 1 lít: Peptone : 2 g K2HPO4 : 0,3 g NaCl : 5 g BPB : 3 ml H2O : 1000 ml pH = 7,0 - 7,2. Cách pha:
- Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn các thành phần môi trường và phân vào các ống nghiệm.
- Hấp ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
- Pha dung dịch glucose 10% trong nước cất rồi lọc vô trùng.
- Thêm 0,3ml dung dịch này vào 2,7 ml môi trường cơ bản ở 50oC.
- Để nguội hoàn toàn rồi cấy vi khuẩn vào và theo dõi trong vòng 5 ngày. - Các ống nghiệm môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh nhiễm tạp.
Môi trường kiểm tra khả năng phân giải H2O2
Môi trường HS : 100ml
H2O2 (3-10%) : 5 ml
Môi trường HS đã được hấp khử trùng và đổ đĩa, cấy vi khuẩn để kiểm tra.
d. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Thành phần các chất trong 1 lít: Sacchrose : 20 g (NH4)2SO4 : 8 g (NH4)2HPO4 : 2 g Acetic acid : 12 ml Nước dừa già : 500-1000 ml pH= 4,5- 5,5
Cách pha:
- Các thành phần trên (trừ acetic acid) được cho vào nước dừa già đã được lọc sạch.
2.2.Nội dung nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu của đề tài được thể hiện qua sơ đồ ở hình 2.1
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập vi khuẩn A.xylinum 2.3.1. Phân lập vi khuẩn A.xylinum
Chúng tôi lọc sạch cặn bẩn nước dừa, cho vào bình tam giác 250 ml, đậy bằng giấy báo và để lên men tự nhiên trong vòng 48 giờ ở nhiệt độ phòng từ 28oC- 32oC. Sau 48 giờ trên bề mặt dung dịch nước dừa sẽ xuất hiện váng trắng.
Chúng tôi tiến hành pha loãng váng trắng với nước cất với nồng độ 10-2.
Quá trình pha loãng được thực hiện như sau:
- Lấy 1 ml dịch có chứa váng tráng cho vào ống nghiệm 1, sau đó bổ sung 9
ml nước cất vào và trộn đều.
- Hút lấy 1 ml dung dịch trong ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2 và bổ sung vào 9 ml nước cất, trộn đều.
Quá trình cấy trang được tiến hành như sau:
- Thao tác cấy được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Các dụng cụ cần thiết như
đĩa pettri, que cấy đều được rửa sạch và sấy khô ở 160oC trong 2 giờ. Quá trình cấy
được thực hiện bên ngọn lửa đèn cồn.
- Đun môi trường HS (đã hấp khử trùng) cho hòa tan hoàn toàn các thành phần
rồi để nguội xuống khoảng 40oC. Tiến hành rót 15- 20 ml dung dịch vào các đĩa pettri và chờ đến khi thạch đã nguội hoàn toàn thì tiến hành cấy.
- Hút 100 µl dịch pha loãng.
- Dùng que cấy trang để trang đều dịch mẫu lên bề mặt thạch.
- Đĩa thạch sau khi cấy xong sẽ được gói lại bằng giấy báo, úp ngược.
- Điều kiện nhiệt độ phòng từ 28oC- 32oC.
- Sau 48 giờ tiến hành quan sát các đĩa thạch.
Quá trình cấy ria:
- Môi trường HS đã hấp khử trùng được đun sôi lại và để nguội đến khoảng
45-50oC thì tiến hành rót từ 15-20 ml vào đĩa pettri.
- Dùng que cấy ria chọn khuẩn lạc đặc trưng của A. xylinum sau khi đã cấy trang để ria.
- Đĩa thạch sau khi cấy xong sẽ được gói lại bằng giấy báo, úp ngược. - Điều kiện nhiệt độ phòng từ 28oC- 32oC.
2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn A. xylinum
Để xác định hình thái vi khuẩn, chúng tôi tiến hành nhuộm Gram.
Tiến hành thí nghiệm
- Khoanh vùng vị trí cần để phết khuẩn lạc lên trên lam kính.
- Nhỏ một giọt nước cất vào vị trí vừa khoanh.
- Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc vừa hoạt hóa sau 24 giờ dàn đều lên trên bề mặt lam kính đã được khoanh vùng. Tiến hành hơ nhẹ qua ngọn lửa đèn cồn để cố định tiêu bản và làm khô nước.
- Nhỏ lên 1 vài giọt dung dịch violet và để trong khoảng 30 giây đến 1 phút. - Nghiêng một góc 45o dưới vòi tia để rửa nhẹ.
- Nhuộm tiếp theo bằng thuốc nhuộm Liugol trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa nhẹ với nước bằng bình tia.
- Sau khi nhuộm bằng Liugon thì tiến hành rửa bằng cồn 90o cho đến khi vùng
tiêu bản mất gần hết màu trong khoảng 10-15 giây rồi rửa lại bắng nước cất.
- Cuối cùng, sau khi hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để làm khô, tiến hành nhỏ dung dịch Fuchsin trong thời gian từ 30 giây tới 1 phút và rửa lại bằng nước.
- Để khô tự nhiên hoặc dùng giấy thấm lau tiêu bản cho sạch xung quanh vùng
vi khuẩn, sau đó quan sát bằng vật kính 100X.
2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn A. xylinum
Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng cách đo OD ở bước sóng 600 nm. Dựa vào các số liệu thu được chúng tôi sẽ tiến hành lập đường chuẩn (đường cong sinh trưởng) để xác định các pha sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó tiến hành các bước giữ giống và kiểm tra các đặc tính sinh hóa cho phù hợp với giai đoạn sinh trưởng.
Tiến hành thí nghiệm:
- Pha môi trường HS và hấp khử trùng.
- Tiến hành nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng từ 28oC-32oC, hạn chế sự di chuyển các bình nuôi cấy.
- Đo OD600 sau khi cấy 24 giờ một lần.
- Đo liên tục trong 7 ngày.
- Dựng đường cong sinh trưởng của các chủng A. xylinum.
2.3.4. Xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn A. xylinum
a. Phản ứng catalase
Mục đích:
Chúng tôi kiểm tra khả năng sinh enzyme catalase của A. xylinum để phân giải H2O2.
Tiến hành thí nghiệm:
- Dùng dung dịch H2O2 có nồng độ từ 3-10%, nhỏ vài giọt lên bề mặt lam kính.
- Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc của vi khuẩn sau hoạt hóa 24 giờ trộn đều
với H2O2 rồi để yên một lúc.
- Quá trình thao tác được thực hiện bên ngọn lửa đèn cồn và trong tủ cấy vô trùng.
- Quan sát: Nếu có hiện tượng sủi bọt khí chứng tỏ vi khuẩn có khả năng phân giải
H2O2.
b. Xác định khả năng chuyển hóa ethanol thành acetic acid
Mục đích:
Dùng để phân lập và kiểm định các vi khuẩn thuộc họ Acetobacter.
Tiến hành thí nghiệm:
- Pha môi trường kiểm tra khả năng chuyển hóa ethanol thành acid.
- Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
- Ethanol được bổ sung vào môi trường trước khi tiến hành cấy.
- Tiến hành rót 15-20ml môi trường vào các đĩa pettri và để nguội.
- Hút 100 µl dịch chứa vi khuẩn cho vào đĩa và dùng que cấy trang trang đều
dịch ra khắp bề mặt thạch.
- Sau đó úp ngược và gói lại bằng giấy báo, để trong điều kiện nhiệt độ phòng
c. Xác định khả năng chuyển hóa glucose thành acetic acid
Mục đích:
Chúng tôi kiểm tra khả năng chuyển hóa glucose thành acid.
Tiến hành thí nghiệm:
- Pha môi trường cơ bản và dung dịch cacbohydrat đem hấp khử trùng ở
121oC trong 15 phút.
- Rót 2,7 ml môi trường cơ bản vào ống nghiệm và thêm 0,3 ml dung dịch đường glucose 50%. Sau đó bịt kín bằng bông và giấy bạc.
- Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng cần xác định cấy vào ống
nghiệm chứa môi trường.
- Ống nghiệm được đặt trong điều kiện nhiệt độ phòng 28oC - 32oC và quan
sát liên tục trong 5 ngày.
- Mọi thao tác đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
d. Xác định khả năng tạo màng BC
Mục đích:
Chúng tôi muốn kiểm tra khả năng tạo màng của chủng cần xác định.
Tiến hành thí nghiệm:
- Hòa tan các chất gồm saccharose, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 vào nước dừa và đun sôi 15 phút.
- Rót 150 ml vào các bình tam giác đã được sấy khô ở 160oC trong 2 giờ.
- Để nguội khoảng 40oC thì bổ sung acetic acid 40% và điều chỉnh pH= 5-5,5.
- Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng cần xác định cấy vào môi trường nuôi cấy.
- Nút miệng bình tam giác bằng giấy báo và đặt trong nhiệt độ phòng 28oC-
2.3.5. Bảo quản chủng giống
Mục đích:
Lưu giữ chủng giống để sử dụng trong thời gian dài từ 3-6 tháng.
Tiến hành bảo quản:
- Nuôi cấy vi khuẩn trong các bình tam giác chứa môi trường lỏng.
- Dựa theo đường cong sinh trưởng để xác định đúng thời điểm vi khuẩn sinh
trưởng mạnh nhất.
- Hút lấy 1,5 ml dịch môi trường nuôi cấy cho vào ống eppendorf sau đó thêm
vào glycerol theo tỉ lệ 7: 3.
- Vortex nhẹ cho đều hỗn hợp, rồi đem bảo quản ở -80OC.
2.3.6. Nuôi cấy tạo màng BC
- Khi đã xác định được chủng giống cần tìm thì tiến hành nhân giống trên môi trường nước dừa để nuôi tạo màng.
- Lên men bề mặt trên các khay nhựa có kích thước 20 x 30.
- Các khay được rửa sạch, tráng qua nước sôi và phun cồn để khử trùng - Môi trường lên men có các thành phần sau:
• Nước dừa già : 1000ml
• Đường saccharose : 20 g (2%)
• (NH4)2SO4 : 8 g (0,8%)
• (NH4)2HPO4 : 2 g (0,2%)
• Acetic acid : 12 ml (1,2%)
- Các thành phần trên (trừ acetic acid ) được cho vào nước dừa già đã được lọc sạch.
- Nấu sôi, để nguội khoảng 40oC, bổ sung acetic acid vào.
- Cấy giống vào và trộn đều, lượng giống bổ sung vào phải chiếm tỷ lệ 10% .
- Sau đó phân vào các khay nhựa và đậy kín bằng giấy báo sạch rồi xếp chống
Hình 2.2. Các bước tiến hành nuôi tạo màng BC
2.3.7. Thu nhận và xử lí màng BC
- Sau 7 ngày lên men, màng BC được hình thành.
- Tiến hành lấy màng ra khỏi môi trường nuôi cấy.
- Sau khi thu sinh khối tiến hành rửa bằng nước lạnh 2-3 lần rồi ngâm trong dung
dịch Na2CO3 5% trong 10 phút để trung hoà acetic acid còn sót bên trong. - Sau đó rửa lại bằng nước vài lần.
- Tiến hành sấy khô ở 90oC.
- Màng sau khi sấy khô sẽ tiến hành tẩy màu và mùi bằng dung dịch NaOCl 10% ± 2.
- Thời gian ngâm trong dung dịch NaClO 10% từ 20-30 phút. - Sau đó rửa lại bằng nước và sấy khô.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập vi khuẩn A. xylinum
Sau nhiều lần tiến hành phân lập vi khuẩn từ váng trắng của nước dừa để lên men tự nhiên 3 ngày, chúng trôi đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn nhưng qua quá trình chọn lọc sơ bộ đã giữ lại 3 chủng có mật độ xuất hiện nhiều và có hình thái khuẩn lạc gần giống với vi khuẩn A. xylinum. (bảng 8)
Dựa vào khóa phân loại của Bergey và các nghiên cứu của Frateur (1950),
Nguyễn Thúy Hương (2009) khi mô tả hình thái vi khuẩn A. xylinum ta cần chọn
lọc chủng có đặc điểm như sau: tế bào hình que, Gram âm, hình thái khuẩn lạc tròn, rìa mép nhẵn, trơn bóng, trắng đục.
Từ kết quả của bảng 8 cho thấy trong số 3 chủng vi khuẩn phân lập được thì
chủng A3 có các đặc điểm gần giống nhất.
Bảng 8. Mật độ và hình thái khuẩn lạc phân lập trên môi trường HS STT Tên chủng Mật độ tế bào
(CFU/g) Hình thái khuẩn lạc
1 A1 0,3.103
Khuẩn lạc tròn, trắng đục, bề mặt nhăn, rìa mép răng cưa, kích thước khuẩn lạc
sau 48 giờ từ 2-3,5mm
2 A2 0,5.103
Khuẩn lạc tròn, rìa mép nhẵn, trắng trong, kích thước sau 48 giờ từ 0,5-1,5mm
3 A3 1,2.103
Khuẩn lạc tròn, rìa mép nhẵn, trơn bóng, trắng đục, kích thước khuẩn lạc sau 48 giờ
từ 1,5-2mm
Mật độ của vi khuẩn A3 khá cao trong môi trường nước dừa lên men tự nhiên. Do vậy, chúng tôi chọn chủng A3 tiếp tục nuôi cấy để quan sát hình thái tế bào, thực hiện các
thử nghiệm sinh hóa như: phản ứng catalase, khả năng chuyển hóa glucose, khả năng chuyển hóa ecthanol, và nuôi tạo màng thử nghiệm.
Hình 3.1. Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn A3 sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường HS ở điều kiện pH= 5, nhiệt độ 28oC-32oC
3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn A. xylinum
Chủng A3 được nuôi cấy trên môi trường HS và nhuộm Gram sau 48 giờ nuôi cấy.
Kết thúc quá trình nhuộm Gram, khi quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính dầu 100X chúng tôi thấy vi khuẩn bắt màu hồng của thuốc nhuộm Fuchsin. Như vậy đây là vi khuẩn Gram (-).
Do thành tế bào vi khuẩn Gram (+) có lớp peptidoglycan dày (phức chất của protein và polysaccharide) và chúng liên kết chặt chẽ với nhau làm giảm tác động
của chất tẩy màu (cồn 96o) do đó sẽ giữ được màu tím của violet sau lần nhuộm đầu
tiên.
Còn đối với vi khuẩn Gram (-), ngoài lớp peptidoglycan mỏng còn lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipodpolysaccharide (gồm lipoprotein và lipopolysaccharide) có bản chất là lipid nên để bị rửa trôi làm mất màu tím violet
khi bị rửa bằng cồn 96o. Sau đó khi nhuộm lại bằng thuốc nhuộm Fuchsin thì sẽ bắt
Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A3 sau khi nhuộm Gram
(Tế bào hình que, không di động, bắt màu hồng thuốc nhuộm Fuchsin, được