IV.1. Khảo sát quá trình tổng hợp Hesperetin thành TriacetylHesperetin. Hesperetin.
Lấy 0,2 gam Hesperetin tinh, 5 ml Anhydric acetic và 0.2 gam Natri acetat cho vào bình cầu sau đó đun hồi lưu cách cát, khuấy nhẹ bằng khuấy từ, dung dịch được khuấy sôi trong 1 phút. Lấy dung dịch này đem đổ vào hỗn hợp nước đá, khuấy đều rồi để yên cho sản phẩm kết tinh xuống. Lọc và rửa lại thật sạch với nước lạnh trên phễu lọc Buchner. Sản phẩm thu được đem sấy chân không ở 80oC đến khối lượng không đổi, thu và cân thô.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp : - Thời gian phản ứng : 1, 5, 10, 15 và 20 phút.
- Lượng dung môi tham gia phản ứng : 1, 2, 3, 4, 5 ml Anhydric acetic.
- Lượng xúc tác tham gia phản ứng : 0.025, 0.05, 0.075, 0.10, 0.125 gam Natri acetat.
Sau khi khảo sát từng yếu tố, chọn ra thơng số phù hợp nhất. Thơng số đó được sử dụng để tiếp tục khảo sát yếu tố tiếp theo.
IV.2. Tinh chế Triacetyl Hesperetin.
Kết tinh lại trong Ethanol :
Cân 1 gam Triacetyl Hesperetin thơ, hịa tan trong 20 ml Ethanol, đun sôi và khuấy nhẹ bằng khuấy từ cho đến khi tan hồn tồn, lọc nóng dung dịch bằng giấy lọc, để yên cho tinh thể kết tinh, lọc áp suất thấp để thu tinh thể Triacetyl Hesperetin, sau đó sấy chân khơng ở 80oC. Đem cân Triacetyl Hesperetin thu được để tính hiệu suất tinh chế.
Luận văn thạc sĩ
V. NHẬN DANH SẢN PHẨM.
V.1. Nhận danh Hesperidin.
Xác định bằng sắc ký lớp mỏng, nhiệt độ nóng chảy, UV-Vis, IR, LC-MS :
V.1.1. Sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy.
- Sắc ký lớp mỏng :
Hồ tan một ít Hesperidin vào dung dịch MeOH. Dịch MeOH vừa pha được chấm lên bản mỏng Silicagel chạy với hệ dung môi n-butanol – acid acetic - nước với tỷ lệ 4 :1 : 5 (lấy lớp trên). Bản mỏng loại 25DC-Alufolien 20x20 cm, Kiesegel 60 F254, Merk.
- Đo nhiệt độ nóng chảy :
Chọn ống mao quản thủy tinh có độ dày đều nhau, đường kính 1-12 mm, dài 70 -100 mm, một đầu hàn kín. Ống phải thật sạch và khơ, cho Hesperidin vào ống mao quản, sau đó xác định điểm chảy bằng máy đo điểm chảy. Điểm chảy được đo 2 lần, kết quả lấy trung bình của 2 lần đo điểm chảy. Sử dụng máy đo điểm chảy ELECTRONTHERMAL 9000 tại phòng hợp chất thiên nhiên Viện Cơng nghệ Hóa học Việt Nam.
V.1.2. Xác định bằng phổ UV–Vis.
Pha dung dịch Hesperidin trong Methanol với các nồng độ xác định. Dùng máy UV 2450 Shimadzu tại Viện Cơng Nghệ Hố Học, đo độ hấp thu dung dịch trong vùng bước sóng từ 200 - 800 nm. Quan sát phổ, xác định cực đại.
V.1.3. Xác định bằng phổ IR .
Phổ IR ghi trên máy quang phổ hồng ngoại IR – Vector 22 Bruker của Viện Cơng Nghệ Hố học.
Luận văn thạc sĩ
V.1.4. Xác định bằng phổ LC-MS.
Phổ LC-MS được ghi trên hệ thống Sắc ký lỏng cao áp LC 1090 Hewlett Parkard ghép khối phổ của hãng MSD-Trap 1100 Aginent.
V.2. Nhận danh Hesperetin.
Xác định bằng sắc ký lớp mỏng, nhiệt độ nóng chảy, UV-Vis, IR, HPLC :
V.2.1. Sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy.
Tương tự phần V.1.1. V.2.2. Xác định bằng phổ UV-Vis. Tương tự phần V.1.2. V.2.3. Xác định bằng phổ IR. Tương tự phần V.1.3. V.2.4. Xác định bằng phổ HPLC.
Phổ HPLC được ghi trên hệ thống Sắc ký lỏng cao áp LC 1090 Hewlett Parkard.
V.3. Nhận danh Triacetyl Hesperetin.
Xác định bằng sắc ký lớp mỏng, nhiệt độ nóng chảy, UV-Vis, IR, HPLC, NMR :
V.3.1. Sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy.
Tương tự phần V.1.1. V.3.2. Xác định bằng phổ UV–Vis. Tương tự phần V.1.2. V.3.3. Xác định bằng phổ IR. Tương tự phần V.1.3. V.3.4. Xác định bằng phổ HPLC. Tương tự phần V.2.4.
Luận văn thạc sĩ
V.3.5. Xác định bằng NMR.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC 200, tần số 500 MHz tại Viện Hóa học Hà Nội.
Luận văn thạc sĩ
VI. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN.
Các mẫu được thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tại phịng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên – Viện KH & CN Việt Nam.