Bài thuốc “Thống tả yếu phương” theo “Đan khê tâm pháp”. 2.1.1.1. Thành phần - tỷ lệ trong bài thuốc
+ Bạch Truật sao (Rhizoma Atractylodis Macrocephalae) 120g – 40% + Bạch thược sao (Radix paeoniae Lactiflorae) 80g – 26,7% + Trần bì sao (Pericarpium Citri reticulatae Perenne) 60g – 20% + Phòng phong (Radix Ledebouriellae Seseloidis) 40g – 13,3%
2.1.1.2. Dạng bào chế
Bào chế theo phương pháp cổ điển (Thuốc sắc) do khoa Dược- viện Y học cổ truyền Quân đội sản xuất theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III.
Quy trình sắc thuốc + Chuẩn bị
- Dông cô: Êm sắc thuốc chuyên dụng. - Dung môi: nước sạch,.
- Dược liệu: Bài thuốc TTYP với thành phần và hàm lượng như trên. Có thể sắc 5 thang hoặc 10 thang trong một lần sắc, để uống trong 5 ngày hoặc 10 ngày liên tục. Các vị thuốc đã được bào chế theo tiêu chuẩn dược điển Việt nam III.
- Kiểm tra nguồn cấp nhiệt đảm bảo an toàn. - Kiểm tra thiết bị sắc thuốc hoạt động tốt. + Sắc lần 1
- Cho dược liệu và nước vào Êm. Nếu sắc 5 thang = 150g thì cho 500ml nước.
- Ngâm dược liệu trong nước lạnh 30 phót.
- Đun vũ hoả đến khi nước sôi (đun lửa to từ lúc bắt đầu đun đến khi nước sôi).
- Đun văn hoả đến khi dịch chiết cạn còn 300 ml trong thời gian 30 phót (đun lửa nhá từ khi thuốc sôi, duy trì sôi lăn tăn).
- Rót dịch chiết qua lưới lọc, để riêng. + Sắc lần 2
- Cho nước vào Êm sắc tiếp. Lượng nước bằng 2/3 lần 1 - Đun vũ hoả đến khi nước sôi.
- Đun văn hoả đến khi dịch chiết cạn còn 150 ml trong thời gian 25 phót. - Rót dịch chiết qua lưới lọc, để riêng.
- Bá bã dược liệu, vệ sinh sạch Êm. + Cô dịch chiết
- Gộp dịch chiết lần 1 và 2 vào Êm. - Đun vũ hoả đến khi nước sôi.
- Đun văn hỏa đến khi dịch chiết cạn vừa thể tích cần chiết xuất. Như vậy ta được khoảng 300 ml.
+ Đóng gãi
- Vật liệu bao gói là tói nhựa dược dụng. Đóng dịch chiết theo liều 1 lần uống (60 ml/gói), bảo quản ở nhiệt độ từ 5-15°C, hạn sử dụng từ 1-3 tháng.
Thuốc sắc dùng để nghiên cứu trên thực nghiệm, chóng tôi dùng với liều 25g dược liệu khô/kg thể trọng chuột/ngày.
- Với quy trình sắc như trên chúng tôi cô dịch chiết còn tỷ lệ 1:1 (1ml dung dịch có 01g dược liệu). Vậy trong 0,5 ml dung dịch thuốc sắc đã có 0,5g dược liệu để sắc và đủ với liều cho 20g chuột uống.
Bào chế theo phương pháp hiện đại (Viên nang cứng) do khoa Dược- viện Y học cổ truyền Quân đội sản xuất theo tiêu chuẩn Dược điển Việt nam III. Gồm các bước tiến hành:
- Bước 1: Quy trình điều chế từ dược liệu trong bài thuốc thành cao láng. - Bước 2: Quy trình điều chế từ cao lỏng thành bột thuốc khô.
- Bước 3: Quy trình hoàn thiện viên nang cứng “Thống tả yếu phương”. Tất cả các quy trình trên đều phải tuân thủ nghiêm ngặt các phương pháp kiểm nghiệm và đạt tiêu chuẩn cơ sở theo đúng tiêu chuẩn của Dược điển Việt nam III.
Quy trình điều chế từ dược liệu trong bài thuốc thành cao láng.
+ Dược liệu : Bạch truật, trần bì, phòng phong, bạch thược được xử lý theo yêu cầu, rửa sạch, thái, phơi sấy khô và xay dược liệu ở kích thước thích hợp. * Mô tả quá trình chiết xuất :
- Sau khi đã nhận đủ số lượng dược liệu và dung môi theo công thức, tiến hành thấm Èm dược liệu bằng dung môi cồn 700
trong vòng từ 2 -3h . - Thêm tiếp cồn 700 vào với tỷ lệ Dược liệu – Dung môi (1:5).
- Tiến hành chiết xuất đưa khối dược liệu vào máy chiết siêu âm. Rút dịch chiết lần 1 tính từ lúc bắt đầu sôi là sau 2 giê. Phần bã dược liệu tiếp tục làm như trên 3 lần, thu được dịch chiết 2, 3, 4.
- Gộp các dịch chiết lại để trong phòng lạnh 48 giê. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuyển dịch chiết sang hệ thống lọc, lấy dịch trong, loại bá cặn.
- Dịch trong được chuyển sang hệ thống cô sơ bé trong điều kiện áp suất thấp 100 mmHg – 200 mmHg và nhiệt độ 450C tới khi dịch chuyển thành cao láng.
Quy trình điều chế từ cao lỏng thành bột thuốc khô. * Mô tả quá trình điều chế :
- Cao lỏng được để trong phòng lạnh 48 giê,
- Sau thời gian quy định chuyển cao sang hệ thống lọc: lọc 3 lần bằng vải dù, bá bã cặn.
- Chuyển cao đã lọc sang hệ thống cô sơ bộ bằng áp suất giảm (nhiệt độ 450
C), đến khi thể chất cao đạt tới độ Èm và tỷ trọng quy định, đổ máng ra khay inox (khay đã được lót giấy bóng kính).
- Chuyển sang tủ sấy hơi (nhiệt độ 500C – 600C) đến khô. - Cao khô tiến hành xay mịn và rây qua cỡ rây 0,5mm. - Thu được bột thuốc khô.
- Kiểm nghiệm bán thành phẩm.
Quy trình hoàn thiện viên nang cứng TTYP.
* Mô tả quá trình đóng viên nang:
- Sau khi đã được bột thuốc khô tiến hành trộn tá dược Lactose theo tỷ lệ. Chó ý phải trộn đều, chuyển sang máy sát hạt.
- Xát hạt: Khối bột thuốc chuyển sang máy xát hạt lắc, xát hạt qua rây 0,5mm, chó ý khi xát hạt không nên đổ quá nhiều, tránh hiện tượng tạo thành
cốm. Hạt xát đến đâu hứng vào khay inox (khay lau cồn 960) tãi máng chuyển sang tủ sấy đến đó.
- Sấy hạt, sửa hạt: Sấy hạt bằng tủ sấy hơi ở nhiệt độ 400
C - 500C trong 15-20 phót. Sửa hạt qua rây cỡ 0,5mm Tiếp tục sấy nhiệt độ 500C- 600C đến khi hạt đạt độ Èm 3%.
- Trộn tá dược trơn: Hạt sau khi sấy khô được trộn đều với bột Talc, Magie stearat theo đúng tỷ lệ bằng máy trộn chữ V.
- Đóng nang:
+ Cốm được đóng vào nang bằng máy đóng nang. Yêu cầu: phòng đóng có máy hót Èm.
+ Trong quá trình đóng nang, nhân viên đứng máy phải kiểm tra nang về hình thức và khối lượng. Lau nang cho sạch, cho nang vào hai lần tói nilon buộc kín có nhãn ghi rõ ràng, để chờ Ðp vỉ.
- Ðp vỉ: Ðp vỉ cứng 10 viên/vỉ. Kiểm tra số lô sản xuất, hạn dùng. - Đóng gãi: + Hộp: đúng số lô sản xuất, hạn dùng theo quy chế. + Đóng gãi: 10 viên nang/vỉ x 10 vỉ/hộp + 01 tờ hướng dẫn sử dụng.
Yêu cầu thành phẩm viên nang: + Công thức cho 1 nang:
- Bét cao khô “Thống tả yếu phương”: 400mg. - Tá dược vừa đủ : 1 viên.
+ Tính chất: viên nang cứng bầu dục màu cam hàm lượng 500 mg, bên trong có chứa bột thuốc khô màu nâu đậm, vị ngọt đắng nhẹ, mùi thơm đặc trưng của bài thuốc “Thống tả yếu phương”.
+ Hình thức đóng gãi:
- 10 viên nang/vỉ x 10 vỉ/1hộp + 01 tờ hướng dẫn sử dông thuốc.
- Nhãn trên mỗi vỉ và mặt ngoài hộp đều in tên thuốc, hàm lượng, nơi sản xuất, công dụng, liều dùng, hạn sử dụng rõ ràng, đẹp, hấp dẫn đúng quy chế.
Bảo quản, hạn sử dụng:
- Bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát.
- Hạn sử dụng 18 tháng kể từ ngày sản xuất. Liều lượng, cách dùng: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Liều dùng trên lâm sàng: Uống 2-3 viên/lần x 3 lần/ngày. - Kiêng kỵ: Tránh uống rượu, bia khi dùng thuốc.
Viên nang “Thống tả yếu phương” dùng để nghiên cứu trên thực nghiệm,
chóng tôi dùng với liều 864mg/kg thể trọng chuột/ngày.
- Để chuột dễ uống, pha thuốc với nước cất thành dạng dung dịch. Cứ 864mg thuốc pha trong 25ml nước cất cho 1kg chuột uống. Vậy 0,5ml dung dịch đã pha có 17,28mg thuốc đủ liều cho 20g chuột uống.
Ảnh 2.1 : Viên nang “Thống tả yếu phương” 2.1.2. Phương tiện và trang thiết bị nghiên cứu
- Èng nhựa hình trụ thông hai đầu, đường kính 2,5cm, dài 15cm, một đầu có chốt hãm bằng sắt ngăn không cho chuột thoát ra khỏi ống.
- Bé kít xét nghiệm Serotonin ELISA (hãng IBL Internationan GMBH của Đức).
- Cân điện tử (Mettler - Toledo, Thụy sỹ, độ nhạy (0,01- 220g). - Tủ sấy (Heraeus, Đức).
- Micropipet 20-200; 200-1000 àL. - Hoá chất EDTA chống đông máu. - Effpendorf 1,5ml.
- Máy li tâm lạnh. - Tủ lạnh sâu -20°C.
- Hệ thống đánh giá hành vi có camera và máy tÝnh tự động theo dõi. - Kim đầu tù dài 7cm.
- Cùng một số vật dụng cần thiết khác.
2.2. đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng (Musmusculus) chủng Swiss giống đực, 80 con, khoẻ mạnh, có trọng lượng 20 ± 2g, do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
Chuột thực nghiệm được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại phòng thí nghiệm của khoa Nghiên cứu thực nghiệm - Viện YHCT Quân đội, và Trung tâm nghiên cứu Y Dược học quân sù - Học viện Quân y trong suốt thời gian nghiên cứu.
Chuột được làm quen với môi trường mới 3-5 ngày trước khi làm thí nghiệm tại Trung tâm nghiên cứu Y Dược học quân sự – Học viện Quân y.
2.3. phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu theo phương pháp thực nghiệm quan sát, mô tả, so sánh.
2.3.1. Nguyên lý của thực nghiệm
Chuột khi bị ngâm nước dài ngày như một tác nhân stress ảnh hưởng rất mạnh gây rối loạn hoạt động thần kinh nói chung và hệ thống thần kinh giao cảm, phó giao cảm nói riêng. Do vậy, một trong những biểu hiện liên quan đến stress kéo dài là rối loạn nhu động ruột với biểu hiện phân táo hoặc lỏng hoặc hỗn hợp. Bên cạnh đó là các dấu hiệu biểu hiện sự giảm các hoạt động bình thường, thể hiện sự sợ hãi, Ýt tiếp xúc với cộng đồng.
2.3.2. Phương pháp tiến hành
2.3.2.1. Gây mô hình HCRKT thể can uất tỳ hư theo phương pháp của Bradessi [44]
Chuột nhắt trắng 80 con đủ tiêu chuẩn thí nghiệm được chia thành 4 lô nghiên cứu, mỗi lô 20 con :
- Lô 1, lô 2, lô 3: Gây mô hình HCRKT trong 10 ngày. - Lô 4 : Được nuôi trong điều kiện bình thường.
Cách tiến hành gây mô hình HCRKT: Chuột nhắt trắng được cho vào ống nhựa hình trụ và đặt vào hệ thống giá đỡ, đầu có chốt hãm ở trên. Đồng thời phía dưới hệ thống giá đỡ ta đặt máng có vách ngăn chia từng ô tương ứng với từng ống nhựa. Sau đó toàn bộ hệ thống giá đỡ được ngâm trong nước ở nhiệt
độ 22 ± 1°C. Mức nước ngâm cách đầu trên của ống hình trô khoảng 2cm. Chuột được ngâm nước liên tục 1 giờ/ngày x 10 ngày.
Ảnh 2.2 : Chuột được nhốt trong các ống hình trụ và bị ngâm nước trong 1h
Mục tiêu của mô hình: Biểu hiện trên chuột bằng các rối loạn về thể trạng, rối loạn tính chất phân, sự phát thải phân, rối loạn về hành vi.
2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu điều trị HCRKT
Sau khi gây được mô hình HCRKT ở 3 lô nói trên. Chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu như sau : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Lô 1 : Sau gây mô hình HCRKT trong 10 ngày, cho uống 0,5ml nước cất trong 10 ngày tiếp theo.
- Lô 2 : Sau gây mô hình HCRKT trong 10 ngày, cho uống thuốc sắc bài TTYP với liều 0,5ml có 0,5g dược liệu cho từng con chuột, uống liên tục trong 10 ngày tiếp theo.
- Lô 3 : Sau gây mô hình HCRKT trong 10 ngày, cho uống viên nang TTYP (dạng bào chế hiện đại). Liều lượng 0,5ml có 17,28mg thuốc pha thành dung dịch cho từng con chuột, uống liên tục trong 10 ngày tiếp theo.
Cả 3 lô nghiên cứu (1,2,3) đều được uống nước cất và thuốc tương ứng như trên vào 8h sáng hàng ngày [71].
2.3.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu được lấy tại 3 thời điểm:
- Trước khi tiến hành thực nghiệm (điều kiện bình thường, chuột khoẻ mạnh).
- Sau khi gây mô hình HCRKT 10 ngày.
- Sau khi điều trị thuốc 10 ngày.
(1). Theo dõi trọng lượng chuột tại 3 thời điểm như trên.
(2). Đếm số lượng phân cứ mỗi 15 phót (trong 1 giê) trong quá trình ngâm nước tại 2 thời điểm trước và sau gây mô hình. Chuột ở lô chứng được đặt vào các lồng riêng biệt cùng thời gian như trên.
(3). Nhận xét tính chất và hình dạng phân (rắn, lỏng, khuôn, có màng nhầy...). (4). Xác định tỷ lệ nước trong phân của các nhóm tại 3 thời điểm như trên.
+Phương pháp tính lượng nước trong phân:
- Từng chuột được nhốt trong các lồng riêng. - Thu thập phân mới trong vòng 1 giê.
- Phân được cân xác định trọng lượng bằng cân điện tử chính xác tới miligram.
- Sấy phân ở nhiệt độ 100°C trong vòng 24 giê. - Cân lại phân sau khi sấy khô.
- Lượng nước trong phân được tính theo công thức sau: W(%) = x100
F D
F
W - Hàm lượng nước có trong phân. F - Trọng lượng phân tươi.
(5). Xét nghiệm định lượng Serotonin trong máu chuột tại 3 thời điểm như trên. - Serotonin là một sản phẩm trung gian của quá trình trao đổi chất tryptophan và nằm chủ yếu trong các tế bào ưa crom của ruột, tế bào thần kinh của não, tiểu cầu của máu và là chất dẫn truyền thần kinh trong hệ thần kinh trung ương.
- Hầu như tất cả Serotonin trong máu tuần hoàn tập trung ở tiểu cầu. Sự biến đổi nồng độ Serotonin trong máu trước và sau khi gây HCRKT là một tiêu chuẩn để xác định đã gây được HCRKT trên chuột. Đồng thời, sự biến đổi serotonin trước và sau điều trị TTYP cũng là một tiêu chuẩn đánh giá kết quả điều trị HCRKT.
+ Phương pháp tiến hành:
- Cho chuột uống sữa trước khi lấy máu 1h.
- Dùng Pipet lấy 0,3ml máu từ khóe mắt chuột và được chống đông bằng EDTA trong từng ống nghiệm, đánh số tương ứng với số đánh dấu trên chuột.
- Ly tâm để tách các thành phần hữu hình của máu.
- Huyết tương được bảo quản ngay ở điều kiện -20°C cho đến khi tiến hành định lượng.
- Định lượng Serotonin huyết tương bằng phương pháp ELISA. o Kháng thể đặc hiệu kháng Serotonin được gắn vào đáy giếng.
o Sau khi ủ qua đêm, serotonin trong huyết tương sẽ cạnh tranh với chất chuẩn làm cho giếng sau khi bắt màu sẽ nhạt hơn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
o Độ hấp thụ quang học được đo ở bước sãng 405nm.
(6). Xác định các rối loạn hành vi thông qua 2 bài tập Test.
Bài Test khám phá không gian mở
Chuột có tính tò mò, luôn có xu hướng khám phá không gian mới để thu thập thông tin mới của môi trường, qua đó bảo đảm sự an toàn cho bản thân động vật. Đối với hành vi khám phá trong không gian mở là một hình trụ tròn, chuột sẽ có xu hướng sử dụng thời gian nhiều hơn ở vùng ngoại vi so với vùng trung tâm. Phân bố thời gian sẽ thay đổi ở chuột bị rối loạn hành vi, cảm xúc.
* Phương pháp:
Chuột được đặt vào trung tâm của khối hình trụ có đường kính 80cm, cao 50cm. Với thời gian 10 phót, chuột được tự do khám phá không gian mới. Trong quá trình này, camera và máy tính tự động ghi lại quãng đường, thời gian và số lần tiến vào vùng trung tâm và ngoại vi. Chuột bị stress thường có xu hướng sử dụng thời gian ở vùng ngoại vi nhiều hơn so với nhóm chứng. Để bảo đảm tính mới của môi trường, mỗi lô chuột chỉ được ghi hành vi khám phá một lần duy nhất tại các thời điểm khác nhau.
Bài Test hành vi cộng đồng * Nguyên lý:
Chuột là động vật có tính cộng đồng rất cao. Chúng luôn có nhu cầu tiếp xúc với đồng loại, đặc biệt là khi bị nuôi cách ly. Hành vi này thay đổi rất lớn đối với chuột bị tác nhân stress.
* Phương pháp:
Hệ thống thí nghiệm gồm một bể nhựa trong suốt có diện tích đáy (30cm