Ngày 18/8/1997 Thủ tướng Chính phủ chính thức phê duyệt cho phép triển khai vắc xin viêm gan B trong Chương trình Tiêm chủng mở rộng quốc gia và triển khai thí điểm tại 2 thành phố lớn là Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh.
Năm 1998, bắt đầu triển khai vắc xin viêm gan B tại 28 tỉnh/thành phố lúc bấy giờ.
Năm 2001, số đối tượng trẻ em dưới 1 tuổi được tiêm là 375.121 trẻ. Dùng vắc xin viêm gan B sản xuất trong nước cho 17 tỉnh, vắc xin viêm gan B viện trợ của Liên minh tồn cầu vắc xin (GAVI) cho 44 tỉnh cịn lại.
Năm 2002, được sự hỗ trợ của Liên minh tồn cầu vắc xin (GAVI) tăng diện triển khai và số đối tượng triển khai lên đến 987.651.
Năm 2003, 100% xã/phường trong tồn quốc triển khai tiêm vắc xin viêm gan B với tổng số 1.500.113 trẻ dưới 1 tuổi [18], [35].
Lịch tiêm vắc xin viêm gan B được khuyến cáo áp dụng từ năm 2005 đến nay là:
- Mũi 1: Trong vịng 24 giờ sau sinh. - Mũi 2: Lúc 2 tháng tuổi.
- Mũi 3: Lúc 3 tháng tuổi.
1.8. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ ỞVIỆT NAM VIỆT NAM
1.8.1. Trên thế giới
Tại Châu Phi, các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ cĩ HBsAg và tỷ lệ nhiễm HBV là rất cao: tỷ lệ cĩ HBsAg trong trẻ em là từ 1-18%, người lớn từ 6-20.
Ở Bắc Mỹ, Bắc và Tây Châu Âu và Úc, VGVB lây nhiễm 5-7% dân số, hầu hết các bệnh nhiễm trùng VGVB xảy ra ở thanh thiếu niên và thanh niên trong tương đối được xác định các nhĩm nguy cơ cao, bao gồm cả người sử dụng thuốc tiêm, đồng tính nam, nhân viên y tế, bệnh nhân cần truyền máu thường xuyên [63].
Tại các nước Trung Âu tỷ lệ mang HBsAg chỉ từ 0,9-1,9% song các nước vùng Đơng Âu vẫn cĩ tỷ lệ khá cao.
Tại Liên Xơ cũ, tỷ lệ HBsAg ở vùng Tây Bắc và Ural là 2%, cịn vùng Tây Bắc Siberi, Trung Á thì tỷ lệ này là 10-13%. Ở các nước thuộc quần đảo Nam Thái Bình Dương tỷ lệ HBsAg(+) trung bình khoảng 8-20% (thấp nhất 2%,cao nhất 35%) cịn tỷ lệ nhiễm VRVGB khoảng 60-80% (thấp nhất 36%, cao nhất 98%). Các kết quả điều tra trong cộng đồng ở vùng dịch lưu hành cho thấy tỷ lệ mang HBsAg cĩ xu hướng tăng từ tuổi nhỏ (khoảng 2-7%) đến cực đỉnh ở độ tuổi 20-29 (khoảng 20%) hoặc 30-40 (7-12,8%) rồi sau đĩ giảm dần.
Theo Ranger Rogez tại Pháp, nếu mẹ cĩ HBsAg (+) thì 10-30% sẽ truyền VRVGB cho con [69]. Theo khuyến cáo của tổ chức Y tế thế giới tại khu vực Tây Thái Bình Dương, mẹ cĩ HBsAg (+) thì tỷ lệ truyền virus cho con dao động trong khoảng 10-90% [71]. Người mẹ cĩ khả năng lây nhiễm cho con trong thời kỳ chu sinh và sau sinh ở trẻ em Trung Quốc là 40-59% [32].
Theo Irsan Hasan nguy cơ nhiễm VRVGB chu sinh từ trẻ sơ sinh do các bà mẹ cĩ HBeAg (+) vào khoảng từ 70-90%, khoảng 90% các trẻ em vẫn bị nhiễm mạn tính [63].
1.8.2. Ở Việt Nam
Một số nghiên cứu về tình trạng nhiễm VRVGB và các yếu tố liên quan cho kết quả như sau:
Nghiên cứu của Viên Chinh Chiến trên quần thể dân cư ở Nha Trang cho thấy tỷ lệ nhiễm HBsAg là 16,7% [4]. Trên nhân viên y tế miền Trung, tỷ lệ HBsAg (+) là 16.3% [5].
Theo Vũ Hồng Cương, yếu tố nguy cơ lây truyền từ mẹ sang con là 38,38% [10].
Lê Văn Trịnh nghiên cứu trên học sinh trường Trung học Y tế Huế, tỷ lệ HBsAg (+) là 9%. Trong đĩ yếu tố nguy cơ do tiêm chích, chích lễ, châm cứu là 9,45%; do xâu lỗ tai là 5,35%; do gia đình cĩ người bị nhiễm là 15,38% [42].
Nguyễn Hữu Chí, Cao Ngọc Nga nghiên cứu trên sinh viên Y khoa năm 2 tại trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cĩ tỷ lệ HBsAg (+) là 8% [1].
Tại Thừa Thiên Huế, Trần Xuân Chương đã nghiên cứu ở người hiến máu nhân đạo cĩ 11,47% HBsAg (+). Trong đĩ số người được khảo sát cĩ yếu tố nguy cơ do xăm da là 7,2%; do xâu tai là 14,4%; do dùng chung dao cạo là 21,6%; dùng chung bàn chải đánh răng là 10,4%; mẹ truyền cho con là 4,8%; vợ chồng là 4%; người thân trong gia đình là 5,6% [8].
Phạm Văn Lình, Trần Thị Minh Diễm và cộng sự nghiên cứu người từ 3 tuổi trở lên ở Thừa Thiên Huế cĩ tỷ lệ HBsAg (+) là 16,8% [26].
Trần Thị Minh Diễm, Trần Xuân Chương và cộng sự nghiên cứu các yếu tố nguy cơ lây nhiễm VRVGB tại tỉnh Thừa Thiên Huế cho thấy chưa cĩ sự liên quan rõ ràng giữa giữa tỷ lệ HBsAg (+) và tiền sử cĩ sử dụng các dịch vụ y tế. Cĩ nguy cơ lây nhiễm VRVGB cao đối với vợ hoặc chồng nếu cĩ một trong hai người cĩ HBsAg (+); đặc biệt nguy cơ này rất cao khi nam giới cĩ vợ bị viêm gan/ HBsAg (+) trong khi nữ giới HBsAg (+) thì sự liên quan với chồng cĩ tiền sử viêm gan/ HBsAg (+) ít chặt chẽ hơn [12].
Ngơ Viết Lộc, Đinh Thanh Huề, Nguyễn Đình Sơn nghiên cứu tình hình nhiễm VRVGB ở người từ 6 tuổi trở lên ở Thừa Thiên Huế với tổng số mẫu 2.525 cĩ 16,36% cĩ HBsAg (+) [29].
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng
Cán bộ, cơng chức đến khám sức khỏe định kỳ tại một số cơ sở y tế Thành phố Huế trong thời gian từ 01.04.2011 đến 31.12.2011.
Bốc thăm ngẫu nhiên được 2 cơ sở là Bệnh viện trường Đại học Y Dược Huế và Trung tâm Y tế Dự phịng tỉnh Thừa Thiên Huế. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ
- Các đối tượng từ chối tham gia nghiên cứu. - Các đối tượng đến khám ngồi thời gian trên.
2.1.3. Cỡ mẫu
Trong thời gian nghiên cứu cĩ 618 người tham gia vào nghiên cứu. Chúng tơi đã tiến hành phỏng vấn đối tượng, làm các xét nghiệm HBsAg, Anti-HBs, transaminase (AST, ALT)
2.1.4. Tiêu chuẩn xác định nhiễm virus viêm gan B
- Trường hợp đang nhiễm: Cĩ xét nghiệm kháng nguyên: HBsAg (+) - Trường hợp đã nhiễm: cĩ xét nghiệm kháng thể: Anti-HBs (+)
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chung 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chung
Nghiên cứu mơ tả cắt ngang.
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.2.1. Lập phiếu nghiên cứu
Phiếu nghiên cứu gồm 3 phần: - Phần thơng tin chung:
+ Giới tính + Nghề nghiệp + Trình độ học vấn
+ Vùng sinh thái sinh sống + Dân tộc
- Một số yếu tố nguy cơ nhiễm VRVGB: + Tiền sử gia đình
• Cĩ người thân trong gia đình đã và đang bị các bệnh về gan
• Khơng cĩ người thân trong gia đình đã và đang bị các bệnh về gan.
+ Tiền sử cá nhân: Cĩ bệnh về gan hoặc các triệu chứng liên quan đến các bệnh về gan: nước tiểu vàng và mệt rũ người khơng do lao động nặng; rối loạn tiêu hĩa, đau tức hạ sườn phải,...
+ Các thĩi quen sinh hoạt hằng ngày: dùng chung dao cạo, xăm da, dùng chung bàn chải đánh răng, sữa giũa mĩng tay, chân, cắt tĩc...
+ Các thủ thuật y tế: châm cứu, nhổ răng, phẫu thuật...
+ Thơng tin về phịng bệnh: tiêm ngừa vắcxin viêm gan B (cĩ làm xét nghiệm trước khi tiêm; đã tiêm đủ liều).
- Kết quả xét nghiệm: HBsAg, Anti-HBs, transaminase (AST, ALT).
2.2.2.2. Các bước tiến hành
- Liên hệ Phịng Kế hoạch tổng hợp Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế và Khoa Sức khỏe nghề nghiệp, Trung tâm Y tế Dự phịng tỉnh Thừa Thiên Huế để biết thời gian khám sức khỏe của cán bộ - cơng chức.
- Phỏng vấn trực tiếp cán bộ, cơng chức đến khám sức khỏe tại 2 cơ sở trên và thu thập số liệu theo bảng câu hỏi soạn sẵn (kèm theo ở phần phụ lục).
- Tiến hành lấy mẫu máu xét nghiệm HBsAg, Anti-HBs và transaminase.
- Ghi nhận kết quả xét nghiệm. - Tổng hợp kết quả; xử lý thống kê.
2.2.3. Các kỹ thuật xét nghiệm trong nghiên cứu:
2.2.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm HBsAg [46]
- Nguyên liệu: Bộ kít MonolisaTM HBsAg ULTRA của hãng Bio-Rad. - Nguyên tắc kỹ thuật: Monolisa HBsAg ULTRA dựa trên kỹ thuật ELISA “bánh mì kẹp thịt” (Sandwichs). KT đơn dịng đặc hiệu (1) gắn với đáy giếng nhựa, thêm huyết thanh thử vào giếng, phản ứng kết hợp xảy ra nếu cĩ HBsAg. Kháng thể Anti-HBs (2) gắn với HRP (Hoseradish peroxidase) nhằm phát hiện phức hợp KN - KT và sử dụng như chất phản ứng với chất sinh màu TMB (Tetramethylbenzidin) nhờ cĩ peroxidase. Sự xuất hiện màu tương ứng với sự hiện diện của HBsAg.
- Chuẩn bị: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Ổn định bộ kít Monolisa HBsAg ULTRA ở nhiệt độ phịng trước khi tiến hành xét nghiệm chừng 20 phút (Bộ kít được bảo quản ở nhiệt độ 2-80C).
+ Chuẩn bị mẫu huyết thanh (kiểm tra phiếu xét nghiệm, họ tên và lập sơ đồ) và các phương tiện dụng cụ liên quan.
+ Micropipettes (100µl), pipette đa kênh 5ml, 10ml.
+ Dung dịch đệm PPS pha lỗng 1: 25 (10ml + 240ml nước cất) (nếu bị kết tủa ở dung dịch mẹ thì nên để vào 370C cho tan) H2SO4 1mol/lít.
+ Chất sinh màu gồm 1 thể tích TMB và 1 thể tích ure peroxide. + Máy phổ kế đọc kết quả ELISA.
- Tiến hành kỹ thuật miễn dịch gắn enzym: thực hiện trên máy đo mật độ quang 680 của hãng Bio - Rad.
+ Gắn đủ các giếng vào khay (stripholder) theo yêu cầu của số mẫu thử và các chứng dương, chứng âm.
+ Nhỏ 25µl dung dịch pha lỗng huyết thanh vào các giếng.
+ Nhỏ 75µl huyết thanh thử và các chứng vào các giếng (nhỏ mẫu thử trước, mẫu chứng sau), thay các đầu cơn sau mỗi mẫu huyết thanh thử và chứng. Lắc nhẹ khay, ủ các giếng ở 370C trong 60 phút.
+ Nhỏ 50µl cộng hợp cĩ Anti-HBs gắn HPR vào mỗi giếng. Lắc đều và ủ ở nhiệt độ phịng 30 phút.
+ Rửa sạch các giếng 5 lần với dung dịch PBS. Vẩy và đập mạnh các giếng vào giấy thấm để ráo nước (chú ý: khơng cịn bọt khí ở các giếng).
+ Nhỏ 100µl dung dịch cơ chất TMB và ủ ở nhiệt độ phịng 30 phút. + Làm ngừng phản ứng bằng 100µl H2SO4 1mol/lít vào mỗi giếng và lắc nhẹ.
+ Đọc kết quả với máy đọc ELISA ở bước sĩng 450nm. - Kết quả:
+ Bằng mắt thường cĩ thể sơ bộ nhận xét:
• Nếu mẫu thử cĩ màu vàng: HBsAg (+).
• Nếu mẫu thử khơng cĩ màu hoặc màu vàng rất nhạt: HBsAg (-). + Phân tích kết quả
• Tính OD trung bình của chứng âm (ODR3): Ví dụ: Chứng âm R3 OD 1 0,030 2 0,031 3 0,032 4 0,027 Tổng OD của R3 = 0,120
Như vậy OD R3 trung bình = Tổng OD R3 /4 = 0,030
• Tính giá trị ngưỡng (cut-off)):
Giá trị ngưỡng cut-off = ODR3 + 0,050 Ví dụ: ODR3 = 0,030
Cut-off = 0,030 + 0,050 = 0,080
• Điều kiện phản ứng
ODR3 ≤ 0,08
OD R4 ≥1,000
ODR3 x 0,6 ≤ ODR31 ≤ ODR3 x 1,4 ODR3 x 0,6 ≤ ODR32 ≤ ODR3 x 1,4 ODR3 x 0,6 ≤ ODR33 ≤ ODR3 x 1,4 ODR3 x 0,6 ≤ ODR34 ≤ ODR3 x 1,4
Nếu một chứng âm khơng đạt tiêu chuẩn này hoặc cao hơn 40% so với giá trị trung bình của chứng âm (ODR3) thì loại bỏ chứng âm này và tính lại giá trị OD trung bình với 3 chứng âm cịn lại. Chỉ cho phép loại bỏ 01chứng âm đối với thử nghiệm này.
Trong trường hợp giá trị chứng âm thấp (OD trung bình chứng âm thấp hơn 0.010) thì khơng sử dụng tiêu chuẩn loại bỏ này đối với chứng âm R3.
Thử nghiệm phải làm lại nếu tất cả giá trị của chứng khơng đạt điều kiện của phản ứng.
• Tính giá trị của mẫu
Cho mỗi mẫu, tính tỷ số của mẫu như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
R = OD mẫu / giá trị ngưỡng (cut-off)
Đánh giá kết quả
HBsAg ULTRA
0.9 < R < 1: Mẫu được xem là nghi ngờ. Nên lặp lại phản ứng với hai giếng cho mỗi mẫu.
R ≥ 1: Mẫu được xem là dương tính.Tuy nhiên những mẫu này nên được lặp lại phản ứng trước khi đưa ra đánh giá cuối cùng.
- Các quy định kiểm tra chất lượng kỹ thuật và bộ sinh phẩm:
• Chứng âm (NC) phải cĩ OD < 0,200. Loại bỏ chứng âm cĩ OD ≥ 0,200.
• Tính trị trung bình chứng âm Nx.
• NC ≤ 1,4Nx; loại bỏ NC > 1,4Nx và tính lại Nx.
• NC ≥ 0,06Nx; loại bỏ NC < 0,06Nx và tính lại Nx.
• Xét nghiệm cĩ giá trị khi chứng dương (PC) - Nx ≥ 0,400. - Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kít MonolisaTM HBsAg ULTRA:
• Độ nhạy: 100%.
• Độ đặc hiệu: 99,94%.
2.2.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm Anti-HBs[47]
- Nguyên liệu: Bộ kít Monolisa® Anti-HBs PLUS của hãng Bio-Rad. - Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc kỹ thuật ELISA “Sandwichs”, thay vì gắn Anti-HBs vào pha rắn thì là HBsAg.
HBsAg... Anti-HBs... HBsAg - HRP + chất sinh màu Pha rắn mẫu dương enzym - Ag
- Chuẩn bị: tương tự như phần kỹ thuật HBsAg, tuy nhiên chất sinh màu được pha bằng cách:
+ Hịa tan 1 viên ure peroxide trong 10ml nước cất, lắc đều trước khi sử dụng. Sau đĩ lấy 1ml dung dịch ure peroxide này thêm vào chai chứa đệm dành cho cơ chất và dung dịch được gọi là đệm peroxide/substrat.
+ Chất sinh màu TMB - đệm peroxide/substrat: gồm 0,5ml đệm peroxide/substrat đã chuẩn bị ở trên cho vào 5ml nước cất trộn đều. Sau đĩ thêm 100µl TMB và lắc đều (dùng cho 50 giếng thử).
- Tiến hành: thực hiện trên máy đo mật độ quang 680 của hãng Bio - Rad.
+ Gắn đủ các giếng vào khay theo yêu cầu của số mẫu thử và 3 chứng gồm: 1 chứng dương thấp (tương ứng 10mIU/l), 1 chứng dương cao (tương ứng 100mIU/l) và 1 chứng âm.
+ Nhỏ 100µl mẫu huyết thanh thử và chứng vào các giếng (nhỏ mẫu thử trước, mẫu chứng sau) và lắc nhẹ (thay mới các đầu cơn sau sau mỗi mẫu huyết thanh mẫu).
+ Ủ các giếng ở 370C trong 60 phút.
+ Rửa sạch các giếng 4 lần với dung dịch PBS bằng pipette đa kênh. + Vẩy và đập mạnh vào giấy thấm để được ráo (chú ý khơng cịn bọt ở các giếng).
+ Nhỏ 100µl cộng hợp (Anti-HBs đơn dịng gắn HRP) vào các giếng. + Ủ các giếng ở 370C trong 60 phút.
+ Rửa sạch các giếng 4 lần với dung dịch PBS bằng pipette đa kênh. + Nhỏ 100µl chất sinh màu TMB - đệm peroxide/substrat vào các giếng + Ủ các giếng ở nhiệt độ phịng (180C - 250C) trong 30 phút. + Làm ngưng phản ứng với 100µl H2SO4 1mol/lít và lắc nhẹ. + Đọc kết quả với máy đọc ELISA ở bước sĩng 450nm. - Kết quả:
+ Đọc tương tự HBsAg nếu chỉ định tính.
+ Trong trường hợp định lượng (hiệu giá kháng thể) thì dùng giấy kẻ li vẽ được đường biểu diễn chuẩn căn cứ vào các chứng dương thấp và dương cao đã biết trước nồng độ Anti-HBs với các OD đọc được trên máy.
Từ kết quả OD của mẫu thử sử dụng đường biểu diễn chuẩn (Hình 2.1), ta cĩ thể tính được nồng độ của Anti-HBs của mẫu thử
Hình 2.1. Đường biểu diễn chuẩn căn cứ vào các chứng dương thấp và dương cao của Anti-HBs. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kít Monolisa® Anti-HBs PLUS + Độ nhạy: 99,20%.
+ Độ đặc hiệu: 99,40%.
Các xét nghiệm này được tiến hành trên dàn máy ELISA của hãng Bio- Rad (bao gồm máy ủ, máy rửa và máy đọc).
2.2.3.3. Xét nghiệm Transaminase: AST, ALT
- Xác định hoạt tính của AST trong huyết thanh: + Nguyên lý:
AST
L. Aspartate + Cetoglutarate Oxaloacetate + L. Glutamate MDH
Oxaloacetate + NADHH+ L. Malate + NAD+
OD
b
a Dương tính thấp (10mIU/l)
Dương tính cao (100mIU/l)
100
+ Hĩa chất:
Hĩa chất 1 (R1) : L. Aspartate : 240mmol/l
MDH : 600U/l
LDH : 600U/l
Chất đệm tris pH 7,8 : 80mmol/l Hĩa chất 2 (R2) : 2 cetoglutarate : 12mmol/l
NADH : 0,18mmol/l
+ Thực hiện:
Trộn hĩa chất R1, R2 theo tỷ lệ 4R1:1R2
Dùng 1ml hỗn hợp trên trộn đều với 0,2ml huyết thanh bệnh nhân ủ trong vịng 1 phút. Đọc sự thay đổi mật độ quang học mỗi 3 phút.
- Xác định hoạt tính của ALT trong huyết thanh: + Nguyên lý:
ALT
L. Alanine + Cetoglutarate Oxaloacetate + L. Glutamate