2.2.1. Phương pháp nghiên cứu chung
Nghiên cứu mơ tả cắt ngang.
2.2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.2.1. Lập phiếu nghiên cứu
Phiếu nghiên cứu gồm 3 phần: - Phần thơng tin chung:
+ Giới tính + Nghề nghiệp + Trình độ học vấn
+ Vùng sinh thái sinh sống + Dân tộc
- Một số yếu tố nguy cơ nhiễm VRVGB: + Tiền sử gia đình
• Cĩ người thân trong gia đình đã và đang bị các bệnh về gan
• Khơng cĩ người thân trong gia đình đã và đang bị các bệnh về gan.
+ Tiền sử cá nhân: Cĩ bệnh về gan hoặc các triệu chứng liên quan đến các bệnh về gan: nước tiểu vàng và mệt rũ người khơng do lao động nặng; rối loạn tiêu hĩa, đau tức hạ sườn phải,...
+ Các thĩi quen sinh hoạt hằng ngày: dùng chung dao cạo, xăm da, dùng chung bàn chải đánh răng, sữa giũa mĩng tay, chân, cắt tĩc...
+ Các thủ thuật y tế: châm cứu, nhổ răng, phẫu thuật...
+ Thơng tin về phịng bệnh: tiêm ngừa vắcxin viêm gan B (cĩ làm xét nghiệm trước khi tiêm; đã tiêm đủ liều).
- Kết quả xét nghiệm: HBsAg, Anti-HBs, transaminase (AST, ALT).
2.2.2.2. Các bước tiến hành
- Liên hệ Phịng Kế hoạch tổng hợp Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế và Khoa Sức khỏe nghề nghiệp, Trung tâm Y tế Dự phịng tỉnh Thừa Thiên Huế để biết thời gian khám sức khỏe của cán bộ - cơng chức.
- Phỏng vấn trực tiếp cán bộ, cơng chức đến khám sức khỏe tại 2 cơ sở trên và thu thập số liệu theo bảng câu hỏi soạn sẵn (kèm theo ở phần phụ lục).
- Tiến hành lấy mẫu máu xét nghiệm HBsAg, Anti-HBs và transaminase.
- Ghi nhận kết quả xét nghiệm. - Tổng hợp kết quả; xử lý thống kê.
2.2.3. Các kỹ thuật xét nghiệm trong nghiên cứu:
2.2.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm HBsAg [46]
- Nguyên liệu: Bộ kít MonolisaTM HBsAg ULTRA của hãng Bio-Rad. - Nguyên tắc kỹ thuật: Monolisa HBsAg ULTRA dựa trên kỹ thuật ELISA “bánh mì kẹp thịt” (Sandwichs). KT đơn dịng đặc hiệu (1) gắn với đáy giếng nhựa, thêm huyết thanh thử vào giếng, phản ứng kết hợp xảy ra nếu cĩ HBsAg. Kháng thể Anti-HBs (2) gắn với HRP (Hoseradish peroxidase) nhằm phát hiện phức hợp KN - KT và sử dụng như chất phản ứng với chất sinh màu TMB (Tetramethylbenzidin) nhờ cĩ peroxidase. Sự xuất hiện màu tương ứng với sự hiện diện của HBsAg.
- Chuẩn bị:
+ Ổn định bộ kít Monolisa HBsAg ULTRA ở nhiệt độ phịng trước khi tiến hành xét nghiệm chừng 20 phút (Bộ kít được bảo quản ở nhiệt độ 2-80C).
+ Chuẩn bị mẫu huyết thanh (kiểm tra phiếu xét nghiệm, họ tên và lập sơ đồ) và các phương tiện dụng cụ liên quan.
+ Micropipettes (100µl), pipette đa kênh 5ml, 10ml.
+ Dung dịch đệm PPS pha lỗng 1: 25 (10ml + 240ml nước cất) (nếu bị kết tủa ở dung dịch mẹ thì nên để vào 370C cho tan) H2SO4 1mol/lít.
+ Chất sinh màu gồm 1 thể tích TMB và 1 thể tích ure peroxide. + Máy phổ kế đọc kết quả ELISA.
- Tiến hành kỹ thuật miễn dịch gắn enzym: thực hiện trên máy đo mật độ quang 680 của hãng Bio - Rad.
+ Gắn đủ các giếng vào khay (stripholder) theo yêu cầu của số mẫu thử và các chứng dương, chứng âm.
+ Nhỏ 25µl dung dịch pha lỗng huyết thanh vào các giếng.
+ Nhỏ 75µl huyết thanh thử và các chứng vào các giếng (nhỏ mẫu thử trước, mẫu chứng sau), thay các đầu cơn sau mỗi mẫu huyết thanh thử và chứng. Lắc nhẹ khay, ủ các giếng ở 370C trong 60 phút.
+ Nhỏ 50µl cộng hợp cĩ Anti-HBs gắn HPR vào mỗi giếng. Lắc đều và ủ ở nhiệt độ phịng 30 phút.
+ Rửa sạch các giếng 5 lần với dung dịch PBS. Vẩy và đập mạnh các giếng vào giấy thấm để ráo nước (chú ý: khơng cịn bọt khí ở các giếng).
+ Nhỏ 100µl dung dịch cơ chất TMB và ủ ở nhiệt độ phịng 30 phút. + Làm ngừng phản ứng bằng 100µl H2SO4 1mol/lít vào mỗi giếng và lắc nhẹ.
+ Đọc kết quả với máy đọc ELISA ở bước sĩng 450nm. - Kết quả:
+ Bằng mắt thường cĩ thể sơ bộ nhận xét:
• Nếu mẫu thử cĩ màu vàng: HBsAg (+).
• Nếu mẫu thử khơng cĩ màu hoặc màu vàng rất nhạt: HBsAg (-). + Phân tích kết quả
• Tính OD trung bình của chứng âm (ODR3): Ví dụ: Chứng âm R3 OD 1 0,030 2 0,031 3 0,032 4 0,027 Tổng OD của R3 = 0,120
Như vậy OD R3 trung bình = Tổng OD R3 /4 = 0,030
• Tính giá trị ngưỡng (cut-off)):
Giá trị ngưỡng cut-off = ODR3 + 0,050 Ví dụ: ODR3 = 0,030
Cut-off = 0,030 + 0,050 = 0,080
• Điều kiện phản ứng
ODR3 ≤ 0,08
OD R4 ≥1,000
ODR3 x 0,6 ≤ ODR31 ≤ ODR3 x 1,4 ODR3 x 0,6 ≤ ODR32 ≤ ODR3 x 1,4 ODR3 x 0,6 ≤ ODR33 ≤ ODR3 x 1,4 ODR3 x 0,6 ≤ ODR34 ≤ ODR3 x 1,4
Nếu một chứng âm khơng đạt tiêu chuẩn này hoặc cao hơn 40% so với giá trị trung bình của chứng âm (ODR3) thì loại bỏ chứng âm này và tính lại giá trị OD trung bình với 3 chứng âm cịn lại. Chỉ cho phép loại bỏ 01chứng âm đối với thử nghiệm này.
Trong trường hợp giá trị chứng âm thấp (OD trung bình chứng âm thấp hơn 0.010) thì khơng sử dụng tiêu chuẩn loại bỏ này đối với chứng âm R3.
Thử nghiệm phải làm lại nếu tất cả giá trị của chứng khơng đạt điều kiện của phản ứng.
• Tính giá trị của mẫu
Cho mỗi mẫu, tính tỷ số của mẫu như sau:
R = OD mẫu / giá trị ngưỡng (cut-off)
Đánh giá kết quả
HBsAg ULTRA
0.9 < R < 1: Mẫu được xem là nghi ngờ. Nên lặp lại phản ứng với hai giếng cho mỗi mẫu.
R ≥ 1: Mẫu được xem là dương tính.Tuy nhiên những mẫu này nên được lặp lại phản ứng trước khi đưa ra đánh giá cuối cùng.
- Các quy định kiểm tra chất lượng kỹ thuật và bộ sinh phẩm:
• Chứng âm (NC) phải cĩ OD < 0,200. Loại bỏ chứng âm cĩ OD ≥ 0,200.
• Tính trị trung bình chứng âm Nx.
• NC ≤ 1,4Nx; loại bỏ NC > 1,4Nx và tính lại Nx.
• NC ≥ 0,06Nx; loại bỏ NC < 0,06Nx và tính lại Nx.
• Xét nghiệm cĩ giá trị khi chứng dương (PC) - Nx ≥ 0,400. - Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kít MonolisaTM HBsAg ULTRA:
• Độ nhạy: 100%.
• Độ đặc hiệu: 99,94%.
2.2.3.1. Kỹ thuật xét nghiệm Anti-HBs[47]
- Nguyên liệu: Bộ kít Monolisa® Anti-HBs PLUS của hãng Bio-Rad. - Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc kỹ thuật ELISA “Sandwichs”, thay vì gắn Anti-HBs vào pha rắn thì là HBsAg.
HBsAg... Anti-HBs... HBsAg - HRP + chất sinh màu Pha rắn mẫu dương enzym - Ag
- Chuẩn bị: tương tự như phần kỹ thuật HBsAg, tuy nhiên chất sinh màu được pha bằng cách:
+ Hịa tan 1 viên ure peroxide trong 10ml nước cất, lắc đều trước khi sử dụng. Sau đĩ lấy 1ml dung dịch ure peroxide này thêm vào chai chứa đệm dành cho cơ chất và dung dịch được gọi là đệm peroxide/substrat.
+ Chất sinh màu TMB - đệm peroxide/substrat: gồm 0,5ml đệm peroxide/substrat đã chuẩn bị ở trên cho vào 5ml nước cất trộn đều. Sau đĩ thêm 100µl TMB và lắc đều (dùng cho 50 giếng thử).
- Tiến hành: thực hiện trên máy đo mật độ quang 680 của hãng Bio - Rad.
+ Gắn đủ các giếng vào khay theo yêu cầu của số mẫu thử và 3 chứng gồm: 1 chứng dương thấp (tương ứng 10mIU/l), 1 chứng dương cao (tương ứng 100mIU/l) và 1 chứng âm.
+ Nhỏ 100µl mẫu huyết thanh thử và chứng vào các giếng (nhỏ mẫu thử trước, mẫu chứng sau) và lắc nhẹ (thay mới các đầu cơn sau sau mỗi mẫu huyết thanh mẫu).
+ Ủ các giếng ở 370C trong 60 phút.
+ Rửa sạch các giếng 4 lần với dung dịch PBS bằng pipette đa kênh. + Vẩy và đập mạnh vào giấy thấm để được ráo (chú ý khơng cịn bọt ở các giếng).
+ Nhỏ 100µl cộng hợp (Anti-HBs đơn dịng gắn HRP) vào các giếng. + Ủ các giếng ở 370C trong 60 phút.
+ Rửa sạch các giếng 4 lần với dung dịch PBS bằng pipette đa kênh. + Nhỏ 100µl chất sinh màu TMB - đệm peroxide/substrat vào các giếng + Ủ các giếng ở nhiệt độ phịng (180C - 250C) trong 30 phút. + Làm ngưng phản ứng với 100µl H2SO4 1mol/lít và lắc nhẹ. + Đọc kết quả với máy đọc ELISA ở bước sĩng 450nm. - Kết quả:
+ Đọc tương tự HBsAg nếu chỉ định tính.
+ Trong trường hợp định lượng (hiệu giá kháng thể) thì dùng giấy kẻ li vẽ được đường biểu diễn chuẩn căn cứ vào các chứng dương thấp và dương cao đã biết trước nồng độ Anti-HBs với các OD đọc được trên máy.
Từ kết quả OD của mẫu thử sử dụng đường biểu diễn chuẩn (Hình 2.1), ta cĩ thể tính được nồng độ của Anti-HBs của mẫu thử
Hình 2.1. Đường biểu diễn chuẩn căn cứ vào các chứng dương thấp và dương cao của Anti-HBs.
- Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kít Monolisa® Anti-HBs PLUS + Độ nhạy: 99,20%.
+ Độ đặc hiệu: 99,40%.
Các xét nghiệm này được tiến hành trên dàn máy ELISA của hãng Bio- Rad (bao gồm máy ủ, máy rửa và máy đọc).
2.2.3.3. Xét nghiệm Transaminase: AST, ALT
- Xác định hoạt tính của AST trong huyết thanh: + Nguyên lý:
AST
L. Aspartate + Cetoglutarate Oxaloacetate + L. Glutamate MDH
Oxaloacetate + NADHH+ L. Malate + NAD+
OD
b
a Dương tính thấp (10mIU/l)
Dương tính cao (100mIU/l)
100
+ Hĩa chất:
Hĩa chất 1 (R1) : L. Aspartate : 240mmol/l
MDH : 600U/l
LDH : 600U/l
Chất đệm tris pH 7,8 : 80mmol/l Hĩa chất 2 (R2) : 2 cetoglutarate : 12mmol/l
NADH : 0,18mmol/l
+ Thực hiện:
Trộn hĩa chất R1, R2 theo tỷ lệ 4R1:1R2
Dùng 1ml hỗn hợp trên trộn đều với 0,2ml huyết thanh bệnh nhân ủ trong vịng 1 phút. Đọc sự thay đổi mật độ quang học mỗi 3 phút.
- Xác định hoạt tính của ALT trong huyết thanh: + Nguyên lý:
ALT
L. Alanine + Cetoglutarate Oxaloacetate + L. Glutamate LDH
Pyruvat + NADHH+ L. Lactate + NAD+
+ Hĩa chất:
Hĩa chất 1 (R1) : L. Alanine : 500mmol/l
LAD : 1200U/l
Chất đệm pH 7,5 : 80mmol/l Hĩa chất 2 (R2) : Cetoglutarate : 15mmol/l
NADH : 0,18mmol/l
+ Thực hiện:
Trộn hĩa chất R1, R2 theo tỷ lệ 4R1:1R2
Dùng 1ml hỗn hợp trên trộn đều với 0,2ml huyết thanh bệnh nhân ủ trong vịng 1 phút. Đọc sự thay đổi mật độ quang học mỗi 3 phút.
- Giá trị bình thường của AST và ALT:
Enzym Nam Nữ
AST 0 - 37 U/l 0 - 31U/l
ALT 0 - 41U/l 0 - 32U/l
2.2.4. Các biến nghiên cứu
- Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu: + Tuổi
+ Giới: nam, nữ.
+ Dân tộc: kinh và dân tộc ít người. + Nghề nghiệp
+ Trình độ học vấn + Nơi sinh sống
- Các chỉ số về nhiễm VRVGB của mẫu nghiên cứu: + Tỷ lệ HBsAg dương tính.
+ Tỷ lệ Anti-HBs dương tính.
- Các yếu tố liên quan nhiễm VRVGB:
+ Các chỉ số về yếu tố liên quan đến HBsAg dương tính:
• Tuổi
• Giới
• Nghề nghiệp
• Nơi sinh sống
• Tiền sự can thiệp y tế
• Thĩi quen, hành vi cĩ nguy cơ.
• Tiêm phịng vắc xin viêm gan B. + Nhĩm cĩ tăng hay khơng tăng men gan:
- Men gan (transaminase) tồn tại trong tế bào gan gấp nhiều lần trong huyết thanh, nên mọi tổn thương tế bào gan trong các trường hợp bệnh lý đều làm tăng hoạt độ của men gan trong huyết thanh. Trong viêm gan cấp hoạt độ men tăng rất cao (5 - 10 lần bình thường), trong khi đĩ men gan tăng thấp trong viêm gan mạn [60].
Trong một số nghiên cứu, mặc dù sự gia tăng AST khơng đặc hiệu cho tổn thương tế bào gan như ALT nhưng sự gia tăng của nĩ thường chứng tỏ một tình trạng tổn thương trầm trọng nhu mơ gan hay tình trạng viêm gan mạn [60].
Đối tượng cĩ men gan được cho là tăng khi hoạt độ ≥ 40 UI/l.
Đối tượng được cho là cĩ viêm gan khi hoạt độ men gan ≥ 80 UI/l (tăng trên 2 lần mức giới hạn trên bình thường).
2.2.5. Xử lý số liệu
- Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê y học, sử dụng chương trình Excel, phần mềm SPSS 11.5.
- Phân tích mối liên quan giữa nhiễm VRVGB với các yếu tố dựa vào giá trị p, và mối liên quan cĩ ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0.05.