Cây Bạch đàn nam hay còn được gọi dưới các tên khác như cây ba sọi lông mềm, ba sọi quả một ô, ba sọi núi cao, ba sọi mép trắng có tên La tinh là Macaranga tanarius (L.) Muell.-Arg, Cây nhỡ cao 6 m, lá có phiến hình lọng, nguyên hình trái xoan hay tam giác, đầu nhọn, có nhiều lông lúc non, lá kèm hình tam giác. Quả nang có đường kính 8 mm, phủ tuyến màu da cam, có gai nhọn, mảnh vỏ 2-3 hạt, hình cầu to 5 mm, ráp. Cây phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trung tâm phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam, Thái Lan, Malaixia, Indonexia, Philipin, Úc. Ở nước ta, có gặp ở Lào Cai, Lai Châu, Lạng Sơn, Hòa Bình và các tỉnh phía nam [2].
Nhân dân ta thường dùng nước sắc của lá để chữa lỵ, nước sắc của rễ để chữa sốt và cầm máu. Nhựa của thân dùng làm keo dán. Y học dân gian Malayxia dùng lá giã nhuyễn để đắp lên vết thương, và cùng dùng rễ để nấu nước trị sốt. Ở Indonexia, nước nấu của vỏ cây dùng uống trị lỵ, vỏ cũng là một vị thuốc dùng cho phụ nữ sinh đẻ uống, nước chiết của lá có tác dụng
kháng sinh đối với chủng Staphylococus. Còn ở Phyllipin, nhựa lấy từ lát cắt
vỏ cây tươi cũng dùng điều trị vết thương, nước sắc rễ dùng trị ho ra máu. Ở một số nơi của nước này người ta còn lấy vỏ và cả lá rụng dùng chế rượu uống. Ở Thái lan M. tanarius được biết đến với tên gọi là “mek”, thuốc sắc từ rễ cây này dùng để hạ sốt, giảm ho. Rễ cây phơi khô được sử dụng như là một thuốc gây nôn. Tại một số địa phương người ta dùng lá cây tươi để đắp lên vết thương với mục đích chống viêm [1,34].
Cho đến nay với những tài liệu tham khảo đã biết, chưa thấy có tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của quả cây M. tanarius. Qua tra
24
cứu tài liệu chúng tôi nhận thấy một số công trình đã công bố tập trung
nghiên cứu về lá và vỏ cây M. tanarius. Kết quả nghiên cứu về thành phần
hóa học của loài này cho thấy lớp chất flavonoid là nhóm chất chính được tìm thấy. Ngoài ra sự có mặt của một số lớp chất khác cũng được ghi nhận.
- Các hợp chất flavonoid:
Trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Đài loan ở Đại học quốc
gia Đài loan, 2 prenylflavanone mới là tanariflavanone A (84) và
tanariflavanone B (85) cùng nymphaeol C (86) được phân lập từ lá của loài cây M. tanarius. Hai hợp chất mới có khả năng ức chế sự trưởng thành của loài Lactuca sativa L (cây rau diếp) [32]. Tiếp tục quá trình nghiên cứu đó, các hợp chất flavonoid là nymphaeol A (87), nymphaeol B (88) và quercetin đã được tìm thấy [33].
Đến năm 2005, nghiên cứu của các nhà khoa học Thái lan cho thấy, dịch chiết n-hexan và chloroform của lá cây M. tanarius thể hiện hoạt tính chống oxy hóa. Từ các dịch chiết này, 2 hợp chất prenyl flavonoid mới là tanariflavanone C (89) và tanariflavanone D (90) đã được phân lập. Ngoài ra 4
hợp chất đã biết cũng đã được tìm thấy là tanariflavanone B (85) nymphaeol C
(86), nymphaeol A (87), nymphaeol B (88). Các nghiên cứu cho thấy các chất này thể hiện hoạt tính ức chế enzym cyclooxygenase-2 [34].
25
Gần đây, Kawakami và các cộng sự đã phân lập được bảy hợp chất flavanone prenyl hóa mới là macaflavanone A-G (91-97). Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này đã được các tác giả khảo sát trên hai dòng
tế bào ung thư là KB và A549. Kết quả cho thấy, hợp chất 97 cho hoạt tính
mạnh nhất đối với cả hai dòng tế bào ung thư trên, với các giá trị IC50 vào
26 - Các hợp chất khác:
Năm 2003, một nhóm nghiên cứu khoa học của trường cao đẳng sư
phạm Đài Bắc, Đài Loan, Trung Quốc đã phân lập và xác định từ lá cây M.
tanarius hợp chất blumenol A (vomifoliol) (98), blumenol B (7,8 dihydro vomifoliol) (99) và roseoside II (100) [34].
Năm 2006, Matsunami và các cộng sự tại trường đại học y sinh học và trường đại học Hiroshima, Nhật Bản đã phát hiện 4 hợp chất mới
megastigmane glucosides, được đặt tên macarangiosides A-D (101-104).
27
trường đại học Hong Kong đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 2 hợp chất diterpenoid 105 và 106. Trong khi trước đó không lâu, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã nghiên thành phần hóa học của vỏ cây này và
28
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật
Mẫu lá và quả loài Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis)
được thu hái tại huyện Quỳ Châu, tỉnh Nghệ An, vào tháng 5 năm 2003. Tên cây được Thạc sỹ Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) định tên. Mẫu số tiêu bản VN 1086 được lưu trữ tại Phòng Tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mẫu lá cây Săng bù (Macaranga kurzii) được thu hái tại huyện Trạm Tấu, tỉnh Yên Bái ngày 06 tháng 3 năm 2001, được nhận dạng và định tên bởi Thạc sỹ Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Mẫu số tiêu bản VN 0810 được lưu trữ tại Phòng Tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Quả cây Bạch đàn nam (M.tanarius) được thu hái tại Á Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế ngày 22 tháng 5 năm 2005 và được Thạc sỹ Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) định tên. Tiêu bản số VN 1507 được lưu giữ tại phòng Thực vật - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu
Các mẫu thực vật sau khi thu hái đều được xử lý như sau:
Mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát,
sấy khô ở nhiệt độ 40-45 oC, sau đó được nghiền nhỏ.
Bột mẫu lá Cleistanthus indochinensis được ngâm chiết với CH2Cl2 5 lần (mỗi lần 24 giờ) sau đó là với MeOH 4 lần (24 giờ /1 lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được các cặn chiết thô CH2Cl2 và MeOH tương ứng.
29
Tương tự như trên, bột mẫu quả cây Cleistanthus indochinensis được ngâm chiết với CH2Cl2 6 lần (24 giờ /1 lần) sau đó là với MeOH 4 lần (24 giờ /1 lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được các cặn chiết thô CH2Cl2 và MeOH tương ứng.
Đối với bột lá cây Macaranga kurzii và bột quả cây Macaranga
tanarius được ngâm chiết với EtOAc 4 lần (24 giờ /1 lần) sau đó là với MeOH 3 lần (24 giờ /1 lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được các cặn chiết thô EtOAc và MeOH tương ứng.
2.3. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ mẫu cây chất từ mẫu cây
Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của cây cũng như các hỗn hợp sau các phản ứng tổng hợp được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC) dùng để khảo sát, sắc ký cột thương (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là RP 18 (Merck), sắc ký cột loại trừ với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck) và sắc ký điều chế pha tĩnh là silica gel.
Sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai là hỗn hợp một số dung môi thông dụng như n-hexan, diclometan, etyl axetat, axeton, metanol, etanol, nước, axit focmic.
Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm (230 – 400 mesh) của Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ
dung môi như n-hexan/diclometan, n-hexan/etylaxetat, n-hexan/axeton,
diclometan/metanol…
Sắc ký cột loại trừ với pha tĩnh là sephadex LH-20 được rửa giải bằng hỗn hợp dung môi methanol hoặc methanol/diclometan 8: 2.
30
Sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là RP-18, hệ dung môi rửa giải là metanol/nước.
2.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ các mẫu cây nghiên cứu và các hợp chất thu được từ các phản ứng tổng hợp.
Độ quay cực được đo trên máy Polartronic D của hãng Haensch (Viện Hóa học) và trên máy Jasco P-2000 Series của Viện Hóa Sinh biển.
Điểm nóng chảy được đo trên máy Boetius B-545 của Viện Hóa học. Việc nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được và các chất bán tổng hợp được thực hiện nhờ sự phối hợp các dữ kiện thu được từ các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS) hoặc phổ khối phun bụi điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HRMS) và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-
NMR, 13C-NMR và DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY)
Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR-Impact-410 bằng phương pháp viên nén KBr. Phổ khối được đo trên máy MS-Engine-5989-HP theo kiểu va chạm electron ở 70 eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc được ghi trên máy HP 5989 B serie II. Phổ khối phân giải cao biến đổi Fourrier FT-ICR-MS được đo trên máy Variance 320-MS. Phổ NMR (cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều được ghi trên máy Bruker Avance 500 với TMS làm chất nội chuẩn. Các thiết bị trên thuộc Viện Hóa học –Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.5. Phương pháp bán tổng hợp các chất
Việc tổng hợp các chất được tiến hành theo các phương pháp tổng hợp hữu cơ thông thường: thực hiện các phản ứng hóa học trong các điều kiện và tác nhân thích hợp để thu được các sản phẩm mong muốn với hiệu suất cao.
31
Việc tinh chế sản phẩm được sử dụng các phương pháp sắc ký hoặc kết tinh trong các điều kiện dung môi thích hợp.
2.6. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào
Các dịch chiết của lá và quả loài C. indochinensis, lá loài M. kurzii và
quả loài M. tanarius, các phân đoạn và các chất sạch phân lập được từ 3 cây
trên được thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên tại Gif-sur-Yvette (CNRS - Cộng hòa Pháp). Các hợp chất bán tổng hợp được thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB tại Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam.
Phép thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập và các dịch chiết của loài C. indochinensis, lá loài M. kurzii và quả loài M. tanarius được tiến hành trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB. Các tế bào KB được bảo quản trong môi trường Dullbecco’s (D-MEM: Dullbecco Medium), sau đó được thêm vào 10% huyết thanh, L-glutamine (2mM), penicilin G (100 UI/ml), steptomycin (100 µg/ml) và gentamicin (10 µg/ml). Dung dịch gốc của các
chất đem thử được pha trong hỗn hợp dung môi DMSO /H2O tỉ lệ thể tích 1/9,
phép thử gây độc tế bào của các chất được tiến hành trên khay 96 giếng làm ba
lần với dòng tế bào ung thư biểu mô vòm họng của người KB (3A0
~103 tế bào/mL) dùng phương pháp cải tiến so với phương pháp đã công bố [37, 38].
Sau khi nuôi cấy trong vòng 72 giờ tại nhiệt độ 370C trong môi trường hỗn
hợp không khí /CO2 (95:5) có hoặc không có hợp chất cần thử, sự phát triển
của các tế bào được đánh giá bằng phương pháp đo màu. Các tế bào còn sống được nhuộm màu bằng chất chỉ thị neutral red. Mật độ quang được đo tại bước
sóng 540 nm trên máy đo quang Titertek Multiscan. Giá trị IC50 được xác định
32
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1. Lá cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis)
3.1.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách
Lá cây Cách hoa đông dương (C. indochinensis) sau khi thu hái được
thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45 oC, sau đó được
nghiền nhỏ thành bột (0,96 kg). Bột mẫu lá được ngâm chiết với CH2Cl2 5
lần (24 giờ/ lần) sau đó là với MeOH 4 lần (24 giờ/lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được 28,8 g và 80 g các cặn chiết thô CH2Cl2 và MeOH tương ứng. Quá trình ngâm chiết được thể hiện trong hình 3.1.
Hình 3.1: Sơ đồ ngâm chiết lá cây Cách hoa đông dương
Cặn chiết CH2Cl2 của lá cây Cách hoa đông dương (28,8 g) được phân
tách sơ bộ trên cột silica gel (190 g silica gel) với hệ dung môi rửa giải là n- hexan/EtOAc bắt đầu từ 5% EtOAc sau đó tăng dần đến 100 % EtOAc để thu được 80 phân đoạn nhỏ (mỗi phân đoạn từ 100-120 ml dung môi), gộp các
Lá cây (0,96 kg) C. indochinensis Cặn CH2Cl2 28,8 g Bã còn lại Cặn MeOH 80 g Bã còn lại - Ngâm chiết CH2Cl2 (5 lần x 24 h) - Cất loại dung môi
- Ngâm chiết MeOH (24 h/lần) - Cất loại dung môi
33
phân đoạn bằng cách kiểm tra trên TLC nhận được 20 phân đoạn thô được ký hiệu từ CLF1 đến CLF 20.
Phân đoạn CLF2 (11,2 g) được đưa lên cột silica gel, dung môi là n-
hexan/ CH2Cl2nhận được 4 phân đoạn nhỏ, ở phân đoạn CLF2.1 tinh chế lại
một lần nữa trên cột silica gel dung môi là 100 % n-hexan thu được 27 mg một
chất dầu ký hiệu là CLF2.1 (12 mg).
Phân đoạn CLF 6 có khối lượng 2,36 g được hòa lại trong n-hexan, phần chất rắn không tan có khối lượng 0,4 g được phân tách trên cột silica gel,
hệ dung môi là n-hexan/CH2Cl2 (6: 4) thu được 6 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn
nhỏ CLF 6.3 kết tinh thu được 1 chất sạch ký hiệu là CLF6.3 (16 mg) và phân
đoạn CLF 6.4 được tinh chế lại bằng sắc ký bản mỏng điều chế thu được 2 mg chất rắn ký hiệu CLF6.4.
Phân đoạn CLF3 (3,54 g) được đưa lên cột silica gel, dung môi rửa giải là n-hexan/CH2Cl2 bắt đầu từ (8,5:1,5) thu được 25 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn
CLF3.1, CLF3.14 và phân đoạn F3.20 kết tinh lại trong hệ n-hexan/axeton và
etanol thu được tương ứng hợp chất CLF3.1 (12 mg), hợp chất CLF3.14 (23
mg) và hợp chất CLF 3.20 (15 mg).
Gộp phân đoạn CLF4 và CLF5 lại được 1,95 g, phân tách trên cột silica
gel, hệ dung môi là n-hexan/axeton, tăng dần từ 1,5% đến 20% axeton, nhận
được 9 phân đoạn. Phân đoạn CLF4.6 kết tinh thu được hợp chất sạch là
CLF4.6 (16 mg).
Quá trình phân lập chi tiết được trình bày trong hình 3.2.
Cặn chiết MeOH (80 g) được hòa lại trong hỗn hợp dung môi n- hexan/axeton (2,5:7,5), phần dung dịch cất loại dung môi được 20 g, ký hiệu là CLFM. Cặn này sau đó được phân tách trên 140 g silica gel, hệ dung môi rửa
giải là CH2Cl2/MeOH (98,5:1,5 →50:50) thu được 14 phân đoạn, ký hiệu là
34
Hình 3.2: Sơ đồ phân lập cặn CH2Cl2 của lá cây Cách hoa đông dương Phân đoạn CLFM4-5 (1,68 g) được tinh chế trên cột silica gel, hệ dung môi là CH2Cl2/EtOAc (8,5:1,5), sau đó tăng dần EtOAc đến 100%. Ở phân
đoạn CLFM 4.1 nhận được chất bột màu vàng sậm ký hiệu là CLFM4.1 (9
mg), còn ở phân đoạn CLFM 4.5 được tinh chế lại trên cột sephadex LH 20,
dung môi là MeOH nhận được chất sạch, ký hiệu là CLFM4.5.1 (9 mg).
Phân đoạn CLFM 8 (400 mg) có phần không tan trong CH2Cl2, lọc và
rửa lại bằng CH2Cl2, thu được một chất sạch ký hiệu là CLFM 8.1 (15 mg).
Dung dịch còn lại cô khô có khối lượng 380 mg được đưa lên tinh chế trên cột silica gel, hệ dung môi là CH2Cl2/axeton, thu được một chất sạch ký hiệu là
CLFM8.1.1 (5 mg).
Phân đoạn F10 (1 g) được đưa lên cột pha đảo RP-18, hệ dung môi là H2O: MeOH (30 – 100% MeOH). Phân đoạn nhỏ FM10.3 được tinh chế lại
Cặn CH2Cl2 lá cây C. indochinensis 28,8 g F4-5 CLF2.1 27 mg - CC, SiO2 n-hexan: EtOAc, gradient F1 F2 F3 F6 F7-11 F12-15 F16-20 F2.1 - CC, SiO2 n-hexan: CH2Cl2 - CC, SiO2 n-hexan F3.1 F3.20 CLF3.20 15 mg CLF3.1 12 mg - CC, SiO2 n-hexan: CH2Cl2 Kết tinh Kết tinh F4.6 CLF4.6 16 mg CC, SiO2 n-hx: ax Kết tinh F6 tan F6 ko tan Hoà lại n-hexan
F6.3 F6.4 CLF6.3 16 mg CLF6.4