Rễ cây được mua về, làm sạch và phơi khô, xác định đúng loại rễ cây cần nghiên cứu bằng cách sử dụng kĩ thuật vi phẫu.
Thực nghiệm vi phẫu rễ cây ngưu tất
Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan trọng trong kiểm nghiệm dược liệu. Trong phần lớn các trường hợp, hình dạng và cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trong khảo sát vi học. Vì vậy, khi quan sát các mẫu ( đặc biệt là các tiêu bản cắt ngang hay dọc của các mô) người ta thường loại bỏ tế bào chất, nhuộm màu màng tế bào để việc quan sát được dễ dàng hơn
- Chọn mẫu: mang tính đại diện, có thể tươi hay mẫu khô ngâm mềm.
- Kết quả vi phẫu:
Hình 2.Hình vi phẫu rễ cây ngưu tất
Xử lý mẫu dƣợc liệu:
Rễ cây ngưu tất sau khi làm sạch sơ bộ được cắt nhỏ và tiến hành loại béo với các dung môi không phân cực ( n- hexane, hoặc ether), bằng nhiều cách, thường sử dụng cách ngâm dầm trong hai tiếng đến bốn tiếng.
- Chiết cao ngưu tất:
Sau khi loại béo, rễ được phơi khô, và dùng dung môi thích hợp ngâm chiết, cô thành cao. Dung môi thường sử dụng như methanol, ethanol. Trong trường hợp này, vì ethanol là một dung môi ôn hòa với môi trường, ít độc hại, dễ kiếm, và giá thành rẻ hơn nhiều so với methanol. Mặt khác, theo các tài liệu tham khảo được, đa số sử dụng ethanol để chiết cao. Và các chế phẩm cao trên thị trường cũng đa phần là cao cồn với các tỷ lệ khác nhau. Với những lí do đó, chúng tôi không sử dụng methanol, mà thay vào đó, chúng tôi sử dụng dung môi chiết cao ngưu tất trong quá trình nghiên cứu là ethanol với sự kết hợp ethanol và nước theo các tỷ lệ nhất định.
Các công trình nghiên cứu tham khảo được đều khảo sát trên ethanol 100 %, 96 %, 70 %. Do đó, chúng tôi khảo sát chiết xuất cao ngưu tất trên ethanol với ba tỷ lệ này.
- Thủy phân saponin trong cao ngưu tất cho ra sapogenin [4,5]
Cao ngưu tất hòa tan với một ít nước, có thể dùng cao lỏng thay thế, sau đó, dùng các tác nhân xúc tác để thực hiện phản ứng thủy phân saponin trong cao ngưu tất cho ra sapogenin, dựa trên phản ứng cắt mạch các phân tử đường. Tác nhân xúc tác là các acid, trong nghiên cứu này chúng tôi nghiên cứu hai tác nhân acid là acid hydrocloric và acid sulfuric, hai loại acid thường dùng.
Các yếu tố khảo sát trong quá trình thủy phân saponin trong cao ngưu tất cho ra sapogenin: [5]
Tác nhân acid: HCl, H2SO4.
Nồng độ acid: HCl 10%, 15%, 20%
Nhiệt độ thủy phân: 80 oC, 90 oC, 100 oC.
- Chiết sapogenin toàn phần: sản phẩm của phản ứng thủy phân
saponin là hỗn hợp các phân tử đường và sapogenin toàn phần. Những dung môi hữu cơ thích hợp để ly trích sapogenin ra khỏi hỗn hợp là cloroform, methylen cloric. Ở đây, chúng tôi tiến hành chiết xuất sapogenin toàn phần bằng dung môi methylen cloric, với lý do methylen cloric có giá thành rẻ hơn và ít độc hại hơn so với cloroform. Sau đó cất thu hồi dung môi, thu gom lấy phần cắn.
- Tách acid oleanolic trong hỗn hợp sapogenin:
Lấy cắn sapogenin cô được hòa tan trong một ít dung môi cloroform rồi cho qua sắc kí cột, sắc kí cột được nhồi từ bột silicagel 60 GF có kích thước hạt 63-200 µm để tách thu từng phân đoạn.
Từ hỗn hợp dung môi chạy sắc kí bản mỏng, chúng tôi khảo sát tỷ lệ dung môi chạy sắc kí cột. Tiến hành hạ dần độ phân cực của hệ dung môi chạy sắc kí bản mỏng, bằng cách giảm tỷ lệ lượng methanol, cứ mỗi lần thay đổi tỷ lệ, cho chấm sắc kí bản mỏng cho chuẩn và nguyên liệu, cho đến khi vệt chấm chuẩn và thử có Rf khoảng 0,2, chúng tôi có tỷ lệ dung môi qua cột là: (cloroform: methanol) ( 50 ml : 6 giọt)
Mẫu qua sắc kí cột được tách ra thành từng phân đoạn, các phân đoạn thu được kiểm tra sự hiện diện của acid oleanolic bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Sau đó thu gom các phân đoạn có chứa acid oleanolic, cho bay hơi dung môi.
Hình 3. Sơ đồ chung về quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất
2.3.3 Tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu thu đƣợc
song song với chuẩn đối chiếu Tinh chế acid oleanolic thu đƣợc:
Khảo sát, chọn lựa phương pháp tinh chế acid Oleanolic: sắc kí cột, bản mỏng, sắc kí điều chế, …
Những phân đoạn chứa acid oleanolic sau khi kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng được gom lại, cho bay hơi dung môi, lấy cắn kiểm tra và cho chạy qua sắc kí cột nhiều lần để có độ sạch cao, có thể cho chạy qua sắc kí cột điều chế nếu chất vẫn chưa sạch. Kết hợp những phương pháp kết tinh và kết tinh lại cho cắn acid oleanolic thu được để có những tinh thể tinh khiết. Những tinh thể này được thu gom nhiều lần, lọc qua giấy lọc dày, và đem sấy khô với nhiệt độ thích hợp, trong quá trình nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nhiệt độ 40 oC. Sau đó, tinh thể được đựng trong bình nâu kín, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 – 8 oC.
Xác định cấu trúc nguyên liệu thu đƣợc:
Từ những tinh thể phân tách bằng sắc kí cột, định tính với chuẩn đối chiếu acid oleanolic bằng sắc kí lớp mỏng, và dùng những phương pháp kết tinh, kết tinh lại để có được những tinh thể tinh khiết; sau đó
gom lại và đem phân tích cấu trúc, độ tinh khiết với mục đích định danh nguyên liệu acid oleanolic phân lập được từ cây ngưu tất.
Xác định cấu trúc của những tinh thể thu được bằng các phương pháp : UV, IR, MNR, để từ những kết quả khảo sát chúng tôi tiến hành xác thực những tinh thể thu được đúng là acid oleanolic.
Định lượng hàm lượng acid oleanolic nguyên liệu thu được bằng phương pháp UV và HPLC, để đánh giá chất lượng của nguyên liệu so với chuẩn đối chiếu được mua từ các hãng hóa chất có tiếng như hãng Sigma.
Đánh giá chất chuẩn cho acid oleanolic nguyên liệu
Acid oleanolic nguyên liệu sau khi qua phân tích kiểm tra là đúng và tinh khiết, chúng tôi đánh giá chất chuẩn nguyên liệu acid oleanolic thực hiện dựa trên các tiêu chuẩn: cảm quan, điểm chảy, phổ UV-VIS, thời gian lưu trên sắc kí đồ HPLC, phổ IR, MNR, ....
Xây dựng quy trình thẩm định phương pháp xác định acid oleanolic bằng phương pháp HPLC/PDA.
2.3.4 Xây dựng qui trình phân tích và áp dụng xác định acid oleanolic trong mẫu thử bằng chuẩn oleanolic nguyên liệu, song song với trong mẫu thử bằng chuẩn oleanolic nguyên liệu, song song với chuẩn đối chiếu bằng phƣơng pháp UV-VIS và HPLC.
Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều sản phẩm dược có tác dụng hạ cholesterol, hạ huyết áp cho người huyết áp cao, sản phẩm ngày càng đa dạng và phong phú. Đa số là dạng nam dược được bào chế từ cao ngưu tất.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây dựng quy trình phân tích acid oleanolic trong viên cao ngưu tất để tiến hành xác định hàm lượng acid oleanolic có trong những mẫu nam dược này, song song với chuẩn đối chiếu mua về.
- Xây dựng phương pháp định lượng acid oleanolic
- Thẩm định phương pháp phân tích từ mẫu thử bằng chuẩn acid oleanolic nguyên liệu, song song với chuẩn mua về.
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Kết quả chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngƣu tất
Tối ƣu các thông số trong quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ cây ngƣu tất
Điều kiện sắc ký bản mỏng:
Dung môi chạy sắc ký: (cloroform: methanol) ( 40:1) Bản mỏng silicagel 60 GF 254.
Thuốc thử phun màu: dung dịch acid phosphomolybdic 5% trong ethanol
Nhiệt độ lên màu: 120 oC
3.1.1 Chiết cao ngƣu tất
Kết quả chiết cao với ethanol tuyệt đối, ethanol 96 % và ethanol 70 %. Thực hiện: cân 3 bình khối lượng bằng nhau, tiến hành chiết tách đồng thời và cùng các điều kiện.
Kết quả sắc ký bản mỏng:
A S B C
Hình 4. Kết quả khảo sát dung môi chiết
Từ trái qua phải, kết quả cho thấy ethanol 70 % cho vệt sắc kí đậm hơn rất nhiều, và số vệt sắc kí ở cả ba dạng khảo sát là bằng nhau. Rõ ràng, phần trăm nước càng nhiều, độ phân cực của dung môi chiết càng tăng, năng suất chiết cao tăng. Tuy nhiên theo các tài liệu tham khảo, quy trình khảo sát ethanol ở 100 %, 96% và 70 %. Ngoài ra, với hàm lượng nước lớn sẽ gây khó khăn trong việc cô cạn dung môi, và có
A: ethanol 100% B: ethanol 96 % C: ethanol 70 %
thể gây ẩm mốc rất nhanh. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát ở ba dung môi trên. Sắc kí đồ cho thấy, ethanol 70 % cho vệt rất đậm, và vệt khá rõ ràng. Cho nên chúng tôi chọn ethanol 70 % làm dung môi chiết xuất cao ngưu tất.
3.1.2 Kết quả thủy phân saponin trong cao ngƣu tất cho ra sapogenin
Khảo sát môi trường acid dùng để thủy phân: acid hydrochlorid và acid sulfuric.
Hình 5. Kết quả khảo sát acid sử dụng thủy phân saponin toàn phần Trong quá trình tách chiết acid oleanolic từ dịch thủy phân, với tác nhân thực hiện phản ứng thủy phân là acid sulfuric thì sự tạo nhũ lớn gây bất lợi cho việc lôi kéo acid oleanolic ra khỏi dung dịch thủy phân.
Do đó, chúng tôi chọn HCl để thủy phân sapogenin
Khảo sát nồng độ acid HCl: HCl 10 %, HCl 15 %, HCl 20 %
Hình 6. Kết quả khảo sát nồng độ acid
HCl S H2SO4 S: chuẩn oleanolic H1: HCl 10% H2: HCl 20% H3: HCl 15% H1 S H2 H3 S: chuẩn oleanolic
Kết quả cho thấy, HCl 15 % và HCl 20 % cho hàm lượng acid oleanolic nhiều tương đương nhau. Và ở kết quả sắc kí của thí nghiệm sử dụng HCl 20 % đã xuất hiện thêm một vệt tạp, vì thế, để tiết kiệm acid HCl, cũng như giảm độ độc hại với môi trường, chúng tôi quyết định chọn HCl 15% trong quá trình nghiện cứu, và tiến hành tối ưu phản ứng trên thông số nhiệt độ và thời gian.
Khảo sát nhiệt độ thủy phân: 80 oC, 90 oC và 100 oC trên bếp cách thủy
Hình 7. Kết quả khảo sát nhiệt độ thủy phân
Với HCl 15 %, kết quả khảo sát ở nhiệt độ 100 oC trên bếp cách thủy cho hàm lượng acid oleanolic nhiều hơn, và đây cũng là nhiệt độ cài đặt tối đa của bếp cách thủy mà chúng tôi sử dụng nghiên cứu, do đó, chúng tôi chọn 100 o
C làm nhiệt độ thực hiện phản ứng thủy phân.
Khảo sát thời gian thủy phân: 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ.
S: chuẩn acid oleanolic
T1: Nhiệt độ thủy phân là 80 oC
T2: Nhiệt độ thủy phân là 90 oC
T3: Nhiệt độ thủy phân là 100 oC
S: chuẩn oleanolic
G1: phản ứng thủy phân diễn ra trong 1 giờ
G2: phản ứng thủy phân diễn ra trong 2 giờ
G3: phản ứng thủy phân diễn ra trong 3 giờ
T1 S T2 T3
Hình 8: Kết quả khảo sát thời gian thủy phân.
Kết quả cho phép chọn thời gian 2 giờ là thích hợp nhất, vì với thời gian phản ứng 1 giờ thì cho hàm lượng acid oleanolic ít, mà với thời gian 3 giờ thì hàm lượng acid oleanolic không tăng so với 2 giờ. Vậy, để tiết kiệm thời gian, chúng tôi chọn thời lượng cho phản ứng thủy phân là 2 giờ
3.1.3 Kết quả chiết sapogenin toàn phần từ dịch thủy phân
Sau khi thực hiện phản ứng thủy phân saponin, chúng tôi tiến hành chiết xuất sapogenin toàn phần bằng dung môi methylen cloric. Sau đó, cho cô quay chân không đến cắn và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trước khi cho qua cột silicagel để tách phân đoạn acid oleanolic. Dịch chiết methylen cloric luôn cho 3 vệt tách khá xa nhau trên sắc kí đồ, trong đó có một vệt tương đương giá trị Rf với chuẩn, một cho giá trị lớn hơn và một vệt cho giá trị nhỏ hơn. Chứng tỏ rằng, trong cắn methylen cloric thu được có sự tồn tại của ba hoạt chất, có độ phân cực khác nhau, trong đó có acid oleanolic, là chất có độ phân cực trung bình so với hai chất còn lại. Nhiệm vụ chúng tôi đặt ra là phải tách được riêng biệt ba chất này, thu gom acid oleanolic.
3.1.4 Kết quả phân tách cắn acid oleanolic thô từ sapogenin toàn phần
Tách phân đoạn chứa acid oleanolic bằng sắc kí cột silicagel 60 GF, kích thước 63-200 µm. Thể tích cho một phân đoạn là 10 ml, các phân đoạn được hứng và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng.
Sau khi qua cột, chúng tôi thu được 9 phân đoạn như sau:
Hình 9. Kết quả kiểm tra các phân đoạn thu được
S: chuẩn oleanolic
Dựa vào những phân đoạn cho vệt sắc kí tương đương Rf với vệt của chuẩn, từ đó chúng tôi thu gom tất cả những phân đoạn chứa acid oleanolic. Trong thí nghiệm minh họa này, acid oleanolic chỉ có trong phân đoạn 5 và 6, nên chúng tôi thu gom phân đoạn 5 và 6, cho bay hơi. Hợp chất thu được chúng tôi đặt tên là NL1
=> Tóm tắt quá trình chiết xuất acid oleanolic từ rễ ngƣu tất: Dung môi chiết cao ngưu tất: ethanol 70 %
Acid sử dụng thủy phân saponin thành sapogenin: acid hydrocloric 15%
Điều kiện thủy phân: nhiệt độ 100 o
C, trong thời gian 2 giờ.
Hình 10. Quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất. Hiệu suất chiết:
Bảng 2. Hiệu suất chiết acid oleanolic từ cao và dược liệu rễ cây ngưu tất
Rễ ngưu tất Cao cồn Cao CH2Cl2 Acid oleanolic Khối lượng (g) 100.5 18.95 0.1398 0.0949 Hiệu suất (%) 18.86 0.738 67.85
Hàm lượng acid oleanolic trong cao cồn: 0.5 % Hàm lượng acid oleanolic trong rễ ngưu tất: 0.094 %
Quy trình chiết này tiêu tốn số lượng dung môi và hóa chất như sau: 500 ml ethanol 70 %, 130 ml HCl 15 %, 400 ml methylene chloric, 25 g bột silicagel, 250 ml chloroform, 50 ml methanol.
3.2 Kết quả tinh chế, định danh và đánh giá acid oleanolic nguyên liệu
thu đƣợc song song với chuẩn đối chiếu
3.2.1 Kết quả tinh chế và định danh acid oleanolic
Kết tinh cắn acid oleanolic thu được sau khi chạy qua sắc kí cột
Sử dụng một lượng methanol vừa đủ, hòa tan cắn acid oleanolic, thêm một ít bột than hoạt tính và tiến hành lọc qua giấy lọc, để bay hơi tự nhiên, thu được hợp chất NL1 có dạng hình kim, màu trắng. Thực hiện nhiều lần để có độ sạch cao.
T1 S T2
Hình 11. Kết quả chấm sắc kí của NL1 với chuẩn acid oleanolic
Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất NL1
Hợp chất NL1 kết tinh lại từ các phân đoạn 5 và 6 , có đặc điểm sau: T1: Thử NL1
S: Chuẩn acid oleanolic
Dạng bột trắng.
Điểm nóng chảy: 310.8 oC (phụ lục 01)
Sắc ký lớp mỏng cho một vết duy nhất ở Rf = 0.6 trong hệ dung môi (cloroform: methanol) (40:1), phun thuốc thử hiện hình dung dịch acid phosphormolybdic 5 % trong ethanol 96 %, nung nóng bản cho vết màu đen (hình 11).
Kết quả phổ UV-VIS [phụ lục 02]
Thiết bị sử dụng: máy đo quang phổ UV-VIS shimadzu UV- 2540 Chuẩn: cân chính xác khoảng 5.7 mg vào bình định mức 25 ml, hòa tan và định mức bằng methanol.
Nguyên liệu: cân chính xác khoảng 5.7mg vào bình định mức 25 ml, hòa tan và định mức bằng methanol.
Trắng: dung môi hòa tan, methanol.
Tiến hành quét phổ cho mẫu trắng, chuẩn và thử ở dãy bước sóng từ 190 – 350 nm
Kết quả: chuẩn và thử cho dãy phổ hấp thu trùng khớp, với ba bước sóng cực đại gồm 250.50 nm; 242.0 nm; và bước sóng chính là 207 nm.
Định tính bằng phổ IR [phụ lục 03]
Thiết bị sử dụng: máy đo phổ hồng ngoại Nicolet Sử dụng kỹ thuật dập viên KBr
Chuẩn: sử dụng một lượng nhỏ, tiến hành dập viên KBr, đo phổ IR.