Lactobacillus LB1 tuyển chọn
Chủng vi khuẩn Lactobacillus LB1 và các chủng vi khuẩn kiểm định được nuôi cấy riêng rẽ sau 48 giờ trong môi trường dịch thể ở điều kiện thích hợp, cho tiếp xúc trực tiếp vi khuẩn Lactobacillus LB1 với từng chủng vi khuẩn
E.coli LB3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
kiểm định. Xác định khả năng tồn tại của mỗi chủng trong hỗn hợp sau các khoảng thời gian nhất định.
Bảng 3.9. Khả năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh của chủng
Lactobacillus LB1 Chủng vi khuẩn kiểm định Mật độ ban đầu (CFU/ml)
Mật độ sau khi tiếp xúc với chủng LB1 theo thời gian (CFU/ml)
6h 24h 48h 72h
E. coli 7,3 x 108 2,4 x 105 1,8 x 104 1,2 x 102 -
Salmonella 1,1 x 108 7,5 x 105 3,5 x 104 2,8 x 102 -
(-): Không xác định được ở nồng độ pha loãng 10-1
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng Lactobacillus LB1 đối kháng được cả 2 chủng vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm, thời gian ức chế nhanh (sau 6h tiếp xúc, nồng độ tế bào các VK gây bệnh đều giảm mạnh, E. coli và
Salmonella giảm từ 108CFU/ml xuống 105CFU/ml). Khả năng kháng khuẩn
nhanh, chỉ sau 72h tiếp xúc trực tiếp các chủng vi sinh vật gây bệnh đã bị ức chế hoàn toàn. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn Lactobacillus LB1 có thể bổ sung vào chế phẩm xử lý chất thải chăn nuôi sẽ có hiệu quả làm giảm mùi hôi thối và sự lan truyền nguồn bệnh.
3.3.3. Khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của chủng Lactobacillus LB1
tuyển chọn
Ngoài axit lactic l à tác nhân diệt khuẩn, cần phải đánh giá chủng vi khuẩn Lactobacillus LB1 có khả năng tổng hợp protein kháng khuẩn hay không? Để tìm hiểu rõ yếu tố kháng khuẩn của chủng vi khuẩn Lactobacillus
LB1, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các thử nghiệm xác định khả năng sinh tổng hợp bacterioxin của chủng vi khuẩn Lactobacillus LB1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
khuẩn của chủng vi khuẩn Lactobacillus LB1 trong điều kiện sinh trưởng và của dịch ly tâm đã được trung hòa pH để làm giảm tác động kháng khuẩn của axit lactic do vi sinh vật sinh ra, từ đó xác định được yếu tố kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus LB1. Căn cứ vào các công trình nghiên cứu đã được công bố về bacterioxin của vi khuẩn Lactobacillus, chúng tôi lựa chọn các chủng vi khuẩn kiểm định có cùng họ hàng hoặc cạnh tranh về dinh dưỡng, môi trường cư trú. Kết quả đánh giá nhanh, định tính phổ kháng khuẩn của vi khuẩn
Lactobacillus LB1 bằng phương pháp đục lỗ thạch và cấy chấm điểm cho thấy
chủng Lactobacillus LB1 có phổ ức chế tương đối rộng với các chủng kiểm định thuộc cả vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-). Tuy nhiên, khi điều chỉnh dịch nuôi cấy về pH7 để loại bỏ tác động của axit lactic thì phổ ức chế bị thu hẹp lại, trong khi khả năng ức chế một số VK gram (-) giảm xuống rõ rệt, vòng ức chế mờ, hầu hết nhỏ hơn 10 mm thì dịch nuôi cấy đã trung hòa vẫn ức chế mạnh nhóm gram (+) trong đó có các chủng gây bệnh như E. faecalis và S. aureus. Kết quả thử nghiệm này rất có ý nghĩa, phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây cho phép đưa ra khả năng chủng Lactobacillus brevis
LB1 sinh tổng hợp bacterioxin kháng khuẩn.
LB1 LB! LB1 LB1 S.aureus Nấm mốc E.coli Salmonella
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.10. Khả năng sinh bacterioxin ức chế một số vi sinh vật gây bệnh của
chủng vi khuẩn Lactobacillus LB1
3.4. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật Sagi Bio-1 xử lý chất lót chuồng nuôi gia cầm
Từ các kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên sinh trưởng, sinh tổng hợp enzym phân giải các hợp chất hữu cơ, khả năng sinh chất ức chế một số vi sinh vật gây bệnh và sự đối kháng giữa các chủng vi sinh vật tuyển chọn cho thấy: có thể sử dụng các chủng này để nhân giống sản xuất chế phẩm VSV xử lý chất lót chuồng nuôi gia cầm. Chúng tôi gọi hỗn hợp các chủng VK và XK trên là chế phẩm vi sinh vật Sagi Bio-1 bao gồm các chủng C3, NB-4, CHP-6 và LB1.
3.4.1. Nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối các chủng vi sinh vật tuyển chọn
- Điều kiện nhân sinh khối VSV: Kết quả nghiên cứu động thái sinh trưởng của 4 chủng VSV (ở các mốc thời gian 24, 48, 72, 96h) đã xác định được thời gian nuôi cấy để mật độ tế bào đạt mức cao nhất, từ đó xác định được thời điểm thu sinh khối thích hợp nhất đối với chủng XK C3 là 72 giờ, các chủng VK NB-4, CHP-6 và LB1 là 48 giờ.
- Tỷ lệ giống cấy: Thí nghiệm được triển khai với các tỷ lệ cấy giống gốc là 1,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cứu đều sinh trưởng và phát triển tốt (đạt mức ổn định > 108CFU/ml). Bổ sung 3-5% giống vào bình lên men vừa thích hợp cho thu sinh khối vừa hiệu quả đối với chi phí sản xuất.
Tổng hợp các yếu tố kỹ thuật thích hợp cho quá trình lên men của 4 chủng vi sinh vật nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Điều kiện thích hợp nhân sinh khối của các chủng VSV tuyển chọn
Thông số kỹ thuật Chủng vi sinh vật tuyển chọn
XK C3 NB-4 CHP-6 LB1
pH 7,5 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 6,5 ± 0,2
Nhiệt độ nhân sinh khối (oC) 37 ± 2 30 ± 2 30 ± 2 30 ± 2
Thời gian nhân sinh khối (giờ) 72 48 48 48
Tỷ lệ giống gốc (%) 3-5 3-5 3-5 3-5
3.4.2. Quy trình tạo chế phẩm vi sinh
3.4.2.1. Nhân giống trong bình nón (giống cấp 1)
Các chủng giống được hoạt hoá bằng cách cấy vào các ống thạch nghiêng cho phát triển tốt, sau đó cấy vào bình nón và lắc trên máy lắc 220 vòng/phút, 48h/30oC với các chủng VK và 72h/37oC với các chủng XK.
3.4.2.2. Nhân giống trong bình lên men 10 lít (giống cấp 2)
Sau khi nhân giống các chủng VK và XK trong bình nón phát triển mạnh, bổ sung 3-5% giống cấp 1 vào bình lên men 10 lít có sục khí, nuôi ở nhiệt độ thích hợp. Kết quả phân tích số lượng của từng nhóm VSV được trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Sự sinh trƣởng của vi khuẩn và xạ khuẩn trong các bình lên men 10 lít
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Thời gian ( giờ)
Mật độ tế bào VK (OD, =560nm))
Sinh khối XK khô (mg/ml) 0 0,156 0,23 12 0,673 0,50 24 1,98 2,39 36 2,35 4,76 48 2,58 6,75 60 1,76 7,54 72 1,42 7,35
Từ kết quả ở bảng 3.11 cho thấy mật độ tế bào của các chủng VK trong bình lên men 10 lít lớn nhất ở 48 giờ, còn sinh khối của các chủng XK ở 60 giờ lên men. Vì vậy, thời gian làm giống cấp 2 của hỗn hợp các chủng VK trong bình lên men tốt nhất ở 36-48 giờ, còn các chủng XK ở 60-72 giờ. Thu nhận sinh khối dịch nuôi cấy phối trộn tạo hỗn hợp chế phẩm vi sinh Sagi Bio-1 để thử nghiệm phối trộn vào chất lót chuồng nuôi gà.
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu các yếu tố thích hợp cho quá trình nhân sinh khối của các chủng VSV và tham khảo các công trình nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV xử lý chất lót chuồng nuôi gia cầm. Quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật Sagi Bio- 1 được tóm tắt theo sơ đồ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.11. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật xử lý chất lót chuồng nuôi gia cầm
3.5. Đánh giá hiệu quả chế phẩm vi sinh vật Sagi Bio-1 trong xử lý chất lót chuồng nuôi gia cầm tại huyện Tam Dƣơng tỉnh Vĩnh Phúc chuồng nuôi gia cầm tại huyện Tam Dƣơng tỉnh Vĩnh Phúc
3.5.1. Kết quả khảo sát hiện trạng môi trường trong chăn nuôi gia cầm tại huyện Tam Dương tỉnh Vĩnh Phúc trước khi tiến hành thử nghiệm huyện Tam Dương tỉnh Vĩnh Phúc trước khi tiến hành thử nghiệm
Để đánh giá thực trạng ô nhiễm do chăn nuôi gia cầm tại huyện Tam Dương, tỉnh Vĩnh Phúc chúng tôi đã tiến hành quan trắc mẫu không khí, lấy mẫu và phân tích các mẫu chất thải của một số hộ chăn. Từ đó, có những đánh giá, kết luận chính xác và đưa ra các phương án xử lý phù hợp với tình hình cụ thể.
Chủng vi khuẩn Hoạt hoá Chủng đã hoạthoá Giống cấp I Giống cấp II Kiểm tra vsv Chế phẩm SagiBio-1 Hỗn hợp Giống cấp II Giống cấp II Giống cấp I Chủng đã hoạt hoá Nhân giống lắc Nhân giống sục Chủng xạ khuẩn Nhân giống sục Nhân giống lắc Hoạt hoá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Khu chăn nuôi nhà ông Nguyễn Thanh Tuấn Một chuồng gà Ai cập nhà ông Quyền
Hình 3.12. Một số hình ảnh khảo sát tại các hộ chăn nuôi gà ở Tam Dương
Chúng tôi đã khảo sát, thu mẫu tại một số hộ gia đình chăn nuôi gia cầm xen kẽ trong khu dân cư với quy mô từ 1000 đến 4000 con gia cầm tại thị trấn Hợp Hòa, huyện Tam Dương và có các kết quả phân tích được tổng hợp trong bảng dưới đây. Trong quá trình khảo sát bằng cảm quan chúng tôi nhận thấy xung quanh khu vực chăn nuôi mùi hôi thối, mùi khai rất khó chịu, một lượng lớn ruồi, nhặng xuất hiện ở đây ảnh hưởng rất lớn tới cuộc sống sinh hoạt của người dân, gây mất mỹ quan môi trường sống.
Bảng 3.12. Kết quả phân tích mẫu khảo sát tại các hộ gia đình ở thị trấn Hợp Hòa, huyện Tam Dƣơng
Chỉ tiêu phân tích M1 M2 M3 M4 Vi sinh vật tổng số(CFU/g) 9,5.109 7,5.109 8,0.1010 3,1.1011 Nấm men (CFU/g) 0 0 0 0 Nấm mốc (CFU/g) 1,2.104 2,0.103 4,1.103 2,5.104 Xạ khuẩn (CFU/g) 1,0.103 0 2,1.102 0 Samonella (CFU/g) 1,5.105 5,0.104 1,5.105 1,3.103 T – Coliform (MPN/g) 1,6.109 5,4.109 3,5.109 1,4.108 F – Coliform (MPN/g) 5,4.106 7,0.107 2,2.108 5,4.107 Khí NH3 (mg/L) 8,21 7,96 8,04 5,12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Khí H2S (mg/L) 20,02 19,08 22,40 11,2
Chú thích:
Ký hiệu mẫu
M1: Mẫu lấy tại chuồng gà công nghiệp đẻ trại gà nhà Ông Nguyễn Ngọc Quyền;
M2: Mẫu lấy tại chuồng gà công nghiệp đẻ trại gà nhà Ông Nguyễn Như Cương; M3: Mẫu lấy tại chuồng gà Ai cập đẻ trại gà nhà Ông Nguyễn Ngọc Quyền; M4: Mẫu lấy tại chuồng gà Ai cập hậu bị trại gà nhà Ông Nguyễn Thanh Tuấn.
Từ bảng tổng hợp kết quả khảo sát trên cho thấy nồng độ các khí NH3, H2S –trong môi trường không khí xung quanh khu vực chăn nuôi ở các mẫu khảo sát đều ở mức cao. Mật độ các loại vi sinh vật gây bệnh như Salmonella,
Coliform, E.coli, nấm mốc trong mẫu chất thải lấy tại các hộ gia đình cũng rất lớn. Đây chính là nguy cơ gây nên các bệnh dịch cho vật nuôi cũng như con người nếu để tiếp xúc với nguồn nước sinh hoạt hay thực phẩm.
Xạ khuẩn xuất hiện trong các mẫu khảo sát với mật độ không nhiều 1,0.103 CFU/g. Trong khi đó các chủng vi sinh vật có lợi lại gần như không tồn tại, do bị các vi sinh vật gây bệnh phát triển mạnh gây ức chế.
Vấn đề đặt ra là chúng ta phải bổ sung các vi sinh vật có lợi vào chất lót chuồng ngay từ ban đầu với mật độ cao nhằm chiếm lĩnh môi trường, gây ức chế sự sinh trưởng, phát triển của các chủng vi sinh vật gây hại ngay từ ban đầu.
3.5.2. Đánh giá hiệu quả chế phẩm vi sinh vật Sagi Bio-1
3.5.2.1 Đánh giá hiệu quả xử lý mùi của chế phẩm vi sinh bổ sung vào chất
lót chuồng nuôi gia cầm
Chất lót chuồng nuôi gia cầm (vỏ trấu) được trải đều lên mặt sàn chuồng nuôi, sau đó phun đều chế phẩm vi sinh lên trên bề mặt chất lót chuồng với liều
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
lượng 05 lít chế phẩm cho 100 m2
sàn chuồng. Trong quá trình nuôi quan sát sự thay đổi độ ẩm của chất lót trong chuồng để tiến hành bổ sung thêm. Thí nghiệm được bố trí như đã trình bày ở mục 2.2.9. Trong quá trình thí nghiệm, định kỳ khi tiến hành lấy mẫu phân tích để đánh giá hiệu quả khử mùi các thí nghiệm chúng tôi thấy mùi hôi thối, mùi khai giảm mạnh ở các chuồng thí nghiệm so với chuồng đối chứng, lượng ruồi nhặng ở các chuồng thí nghiệm cũng giảm rõ rệt so với chuồng đối chứng. Các kết quả phân tích cụ thể được biểu diễn qua các đồ thị ở hình 3.13 và hình 3.14. 0 2 4 6 8 10 12 14 11 20 32 39 46 55
Thời gian duy trì (ngày)
N ồ n g đ ộ k h í N H 3 (m g /m 3) ĐC TN 1 TN2 0 5 10 15 20 25 30 11 20 32 39 46 55
Thời gian duy trì (ngày)
N ồ n g đ ộ k h í H 2 S ( m g /m 3 ) ĐC TN 1 TN2 Hình 3.13. Nồng độ khí NH3 trong khu vực chăn nuôi gia cầm
Hình 3.14. Nồng độ khí H2S trong khu vực chăn nuôi gia cầm
Từ đồ thị ở hình 3.13 và hình 3.14 cho thấy, nồng độ khí NH3, H2S ở chuồng đối chứng có xu hướng tăng cao hơn so với ở các thí nghiệm có bổ sung chế phẩm vi sinh vật theo thời gian. Đến ngày thứ 55 sau khi phun chế phẩm, nồng độ khí NH3, H2S ở các chuồng thí nghiệm chỉ bằng 1/3 so với các chuồng đối chứng. Đây là cơ sở để giải thích cho sự giảm mùi hôi thối rõ rệt ở các chuồng thí nghiệm so với các chuồng đối chứng. Từ đó có thể khẳng định hiệu quả của chế phẩm vi sinh vật khi bổ sung vào chất lót chuồng chăn nuôi gia cầm trong việc hạn chế sự gia tăng nồng độ các khí NH3, H2S, từ đó làm giảm rõ rệt mùi hôi thối trong quá trình chăn nuôi.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.5.2.2. Đánh giá hiệu quả xử lý phân gia cầm của chế phẩm vi sinh vật thông qua các chỉ tiêu vi sinh vật qua các chỉ tiêu vi sinh vật
Để đánh giá hiệu quả xử lý chất thải chăn nuôi gia cầm của chế phẩm vi sinh vật sau khi bổ sung vào chất độn lót chuồng, chúng tôi tiến hành lấy mẫu và phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh. Các kết quả phân tích được biểu diễn qua các đồ thị ở hình 3.15 và hình 3.16. 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 11 20 32 39 46 55
Thời gian (ngày)
M ật đ ộ N ấm m ố c (C F U /g ) ĐC TN TN1 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 11 20 32 39 46 55
Thời gian (ngày)
M ật đ ộ S al m o n el la ( C F U /g ) ĐC TN TN1
Từ kết quả ở hình 3.15 và 3.16 cho thấy, mật độ nấm mốc, Salmonella ở các mẫu thí nghiệm giảm và thấp hơn từ 103
– 104 CFU/g so với các mẫu đối chứng. Có sự chênh lệch này do các chủng vi sinh vật trong chế phẩm đã cạnh tranh dinh dưỡng và ức chế sự phát triển của nấm mốc cũng như Salmonella. Việc hạn
Hình 3.17. Mật độ nấm mốc trong chất thải chăn nuôi gia cầm ở mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng
ĐC TN
Hình 3.15. Mật độ nấm mốc trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
chế sự phát triển của nấm mốc và Salmonella trong chất thải chăn nuôi gia cầm có ý nghĩa rất lớn đối với việc phòng trừ dịch bệnh hô hấp, tiêu chảy ở vật nuôi, làm giảm chi phí, tăng hiệu quả chăn nuôi cũng như hiệu quả kinh tế cho các