Môi trường xenluloza được khử trùng ở 1 atm trong 30 phút sau đó đổ đĩa petri vô trùng. Cấy vi sinh vật và nuôi ở nhiệt độ 30- 37oC, sau 48h lấy ra và thử bằng Lugol. Nếu vi sinh vật có khả năng phân huỷ xenluloza chúng sẽ tạo thành vòng không màu xung quanh khuẩn lạc của chúng.
2.2.5. Xác định hoạt tính bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic
Xác định khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa vi sinh vật kiểm định và vi sinh vật được tuyển chọn.
Thực hiện: Chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi cấy trong 50 ml môi trường MRS ở 30oC, 24 giờ. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 30o
C, thu nhận dịch nổi. Điều chỉnh pH dịch nổi đến 6,5 bằng NaOH 1N. Sử dụng dịch nổi này như bacteriocin thô, đem kiểm tra khả năng đối kháng như sau:
+ Đổ 15 ml môi trường vào đĩa petri vô trùng, để thạch đông. + Trải 10μl dịch nuôi cấy qua đêm chủng vi sinh vật kiểm định. + Đục lỗ có đường kính 1 cm trên thạch tạo các giếng thạch. + Hút 0,5 ml dịch nổi thu được sau khi ly tâm vào giếng thạch. + Cho vào tủ lạnh 4oC/2h cho dịch khuếch tán đều vào thạch.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Đem nuôi trong tủ ấm 30oC/24h.
+ Kiểm tra sự tạo thành vòng vô khuẩn. Đo đường kính vòng vô khuẩn.
2.2.6. Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy lên sinh trƣởng và sinh tổng hợp enzym của các chủng vi sinh vật.
Vi khuẩn, xạ khuẩn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường tương ứng là MPB và Gause lỏng lắc 200 vòng/phút với sự thay đổi lần lượt các yếu tố: pH ban đầu, nhiệt độ, nguồn C, nguồn N. Đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn bằng đo mật độ tế bào trong dịch nuôi cấy (OD). Sau đó ly tâm thu dịch enzym và thử khả năng sinh tổng hợp các loại enzym của các chủng VSV nghiên cứu.
2.2.7. Phƣơng pháp thu mẫu khí và phân tích các khí NH3 và H2S
2.2.7.1. Phƣơng pháp lấy mẫu không khí [11], [22]
Phương pháp lấy mẫu khô
Phương pháp được sử dụng để lấy mẫu không khí là phương pháp lấy mẫu khô. Trong phương pháp này, khí được lấy vào trong bình lấy mẫu nhờ hệ thống bơm hoặc máy hút cho đến khi thể tích của bình được trao đổi với không khí ít nhất 6 lần. Không khí cần phân tích được bơm qua “bình phản ứng”, nơi đã có sẵn các chất hoá học cần thiết. Sản phẩm được hình thành có thể được xác định bằng phương pháp so màu hoặc một số kỹ thuật khác.
Để lấy một lượng nhỏ mẫu khí, có thể sử dụng bơm hút bằng nhựa có nắp đậy rất thuận tiện để lấy mẫu và chuyển mẫu khí sang dụng cụ đo. Một số dụng cụ khác để lấy mẫu khí là một bình có thể bơm khí vào ở áp suất lớn hơn ở khí quyển (như quả bóng chẳng hạn). Do được nén ở áp suất lớn nên chúng dễ dàng chuyển sang dụng cụ đo. Tuy nhiên, do bị nén ở áp suất cao nên các khí có thể khuếch tán qua vỏ bình với vận tốc khác nhau. Vì vậy, không nên để mẫu quá lâu sẽ ảnh hưởng đến thành phần của chúng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đối với một chất khí nào đó có khả năng hoà tan tốt trong nước, có thể dùng nước hấp thụ làm tăng hàm lượng của chúng cho quá trình phân tích. Thường sử dụng nước có thêm những chất thích hợp để tăng khả năng hấp thụ của chúng. Khí phân tích được lọc qua màng lọc để xác định các phần tử rắn bằng kính hiển vi hay phương pháp hoá học.
Phương pháp tiếp cận lấy mẫu ướt
Phương pháp lấy mẫu ướt sử dụng chai hoặc ống lấy mẫu được làm đầy bằng chất lỏng có khả năng hoà tan ít các chất khí. Trong nhiều trường hợp hay sử dụng nước đã được axit hoá. Khi nước được tháo đi, không khí sẽ xâm nhập vào thay thế.
Nhược điểm của phương pháp này là một số chất có thể hào tan vào chất lỏng. Ngược lại, chất lỏng cũng có thể bay hơi vào trong mẫu khí. Hơn nữa, khi lấy mẫu khí cũng như khi chuyển chất khí vào dụng cụ phân tích cần phải sử dụng một lượng khá lớn các chất lỏng.
Đây là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện. Vì vậy, trong phạm vi đề tài này chúng tôi tiến hành lấy mẫu theo phương pháp tiếp cận lấy mẫu ướt.
2.2.7.2. Phƣơng pháp phân tích [2], [10], [12], [21]
Phương pháp phân tích khí NH3
Amoniac có thể có trong không khí dưới dạng lỏng và khí. Đó là loại khí không màu và có mùi khai hắc. Tác hại chủ yếu của nó là làm viêm da và đường hô hấp.
Để phân tích khí NH3 người ta sử dụng phương pháp indophenol. Phương pháp dựa trên cơ sở tác dụng của ammoniac với hipoclorit (là muối của NaClO) và phenol có sự tham gia của chất ổn định phản ứng là natri nitro pruxit, tạo ra hợp chất màu xanh, hấp thụ cực đại tại bước sóng 625 nm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Lượng NH3 trong mẫu thử được xác định bằng phương pháp đường chuẩn theo hiệu số giữa độ hấp thụ quang của mẫu đem đi phân tích và độ hấp thụ quang của mẫu trắng.
Hàm lượng aminoac trong không khí được tính bằng mg/m3
theo công thức:
Phương pháp phân tích H2S
Khí H2S là loại khí không màu, dễ cháy và có mùi rất đặc biệt giống mùi trứng ung. Khi hít thở phải khí H2S gây xuất tiết nước nhầy và viêm toàn bộ tuyến hô hấp. Ở nồng độ 150 ppm hoặc lớn hơn khí H2S gây tê liệt cơ quan khứu giác.
* Xử lý khí H2S bằng xút (NaOH):
Cơ sở của phương pháp này là khí H2S kết hợp với NaOH theo phản ứng sau đây:
H2S + 2NaOH = Na2S + 2H2O (1) Na2S + H2S = 2NaHS (2) Na2S + H2O = NaHS + NaOH (3)
Song song với các phản ứng trên, xút còn có tác dụng với cacbonic: C =
Ba. V0 a.B
Trong đó:
a: Lượng NH3 trong dung dịch mẫu lấy phân tích, mg B: Tổng lượng dung dịch mẫu thử, ml.
Ba: Thể tích dung dịch mẫu lấy để phân tích, ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CO2 + NaOH = NaHCO3 (4) NaHCO3 + NaOH = Na2CO3 + H2O (5)
Ngoài phản ứng khử H2S, trong dung dịch còn xảy ra quá trình oxy hoá natri sunfua Na2S thu được từ phản ứng (1) tạo thành natri hydrosunfua và hyposunfit:
Na2S + H2S = NaHS + NaOH (6) 2NaHS + 2O2 = Na2S2O3 + H2O (7)
Về mặt bảo vệ môi trường, các phản ứng phụ (6) và (7) là có lợi vì chúng góp phần làm giảm nhẹ khâu xử lý dung dịch đã dùng xong trước khi thải ra hệ thống thoát nước.
* Xử lý khí H2S bằng amoniac:
Dùng amoniac để khử H2S trong khí thải là quá trình khá đơn giản và được áp dụng rộng rãi. Trong tháp hấp thụ, H2S trong khí thai tiếp xúc với dng dịch amoniac và chúng kết hợp với nhau theo phản ứng:
2NH3 + H2S = (NH4)2S
Ở nhiệt độ và áp xuất thích hợp amoniac sunfua (NH4)2S phân giải thành NH3 và H2S. Amoniac quay lại chu trình làm việc, còn H2S được đưa sang công đoạn điều chế axit hoặc lưu huỳnh đơn chất.
* Xử lý khí H2S bằng chất hấp phụ oxit sắt Fe2O3:
Đây là phương pháp cổ điển nhất được dựa trên cơ sở các phản ứng: Fe2O3 + 3H2S = Fe2S3 + 3H2O
2Fe2S3 + 3O2 = 2Fe2O3 + 6S
Sau khi bão hoà H2S, oxit sắt được hoàn nguyên bằng không khí (cấp oxy) để thu lưu huỳnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Tốc độ phản ứng hấp phụ H2S của oxit sắt phụ thuộc vào mức độ tiếp xúc giữa khí và bề mặt vật liệu hấp phụ. Do đó, để nâng cao tốc độ phản ứng, độ rỗng (xốp) của vật liệu hấp phụ phải lớn. Thường độ rỗng của oxit sắt không nhỏ hơn 50%.
Điều kiện tốt nhất cho quá trình hấp phụ khí H2S bằng oxit sắt là nhiệt độ nằm trong khoảng 28 – 300C và độ ẩm của vật liệu hấp phụ khoảng 30%.
* Xử lý khí H2S bằng than hoạt tính:
Quá trình hấp phụ khí H2S bằng than hoạt tính xảy ra nhờ hiện tượng oxy hoá khí H2S trên bề mặt của than theo phản ứng:
H2S + ½ O2 = H2O + S + 222 kJ/mol
Để thúc đẩy quá trình oxy hoá người ta thêm vào khí cần lọc một lượng nhỏ amoniac (0,2 g/m3
).
Lưu huỳnh được giải phóng ra trong phản ứng oxy hoá nêu trên dần dần tích tụ trong lớp than và làm cho vật liệu hấp phụ trở nên bão hoà, lúc đó cần tiến hành hoàn nguyên vật liệu hấp phụ bằng amoni sunfua (NH4)2S theo phản ứng:
2(NH4)2S + 6S = 2(NH4)2S4 Hoặc là:
(NH4)2S + (n – 1)S = (NH4)2Sn
Sau đó dung dịch được phân huỷ bằng hơi ở nhiệt độ 125 – 1300
C và áp suất (1,7 – 2).105 Pa để thu lại amino sunfua và lưu huỳnh đơn chất:
(NH4)2Sn → (NH4)2S + (n – 1)S
Lưu huỳnh thu được có thể tách ra khỏi dung dịch nhờ sự khác nhau về khối lượng đơn vị. Độ tinh khiết của lưu huỳnh có thể đạt 99,9%, còn hơi ngưng tụ lại trong quá trình phân huỷ dung dịch là amoni sunfua sạch. Sau khi tách lưu huỳnh ra khỏi than bão hoà, người ta rửa than bằng nước cho tới khi không còn SO2 trong nước mới thôi, sau đó than được sấy khô để dùng trở lại.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.8. Quy trình bổ sung chế phẩm vi sinh vật vào chất lót chuồng nuôi gia cầm cầm
Qua quá trình nghiên cứu, khảo sát các kỹ thuật chăn nuôi gà tại các hộ chăn nuôi gia cầm ở Tam Dương, chúng tôi đã đưa ra quy trình bổ sung chế phẩm vi sinh vật vào chất lót chuồng chăn nuôi gia cầm:
Trải đều chất lót chuồng ra sàn chuồng, phun đều chế phẩm lên trên bề mặt chất lót chuồng theo liều lượng 02 lít chế phẩm cho 100 kg chất lót chuồng (hoặc 05 lít chế phẩm cho 100 m2
sàn chuồng). Sau đó tùy theo sự thay đổi độ ẩm trong chuồng mà bổ sung thêm chất, lót chuồng.
Hình 2.1. Quy trình công nghệ bổ sung chế phẩm vi sinh vật vào chất lót chuồng chăn nuôi gia cầm
Lưu ý: Không sử dụng chất sát trùng để khử khuẩn để phun vào chất lót chuồng khi sử dụng chế phẩm vi sinh
Trải đều chất lót chuồng lên bề mặt chuồng nuôi gia cầm
Phun dịch chế phẩm VSV lên trên bề mặt chất lót chuồng đã trải sẵn
(Liều lượng: 05 lít dịch chế phẩm cho 100 m2
sàn chuồng) Sau 5-7 ngày bổ sung thêm chất lót chuồng tùy vào độ ẩm trong chuồng nuôi gia cầm
Để lại một phần chất lót chuồng để tái sử dụng lượng VSV hữu ích đang có, sau đó bổ sung thêm chất lót chuồng mới.
Thu toàn bộ lượng phế thải trong chuồng và bắt đầu lại quy trình từ bước đầu tiên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.9. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả xử lý chất lót chuồng nuôi gia cầm của chế phẩm Sagi Bio-1 cầm của chế phẩm Sagi Bio-1
Thí nghiệm được bố trí như sau:
1. Đối chứng: Chuồng nuôi gà Ai Cập đang đẻ (500 con), không phun chế phẩm vi sinh vật.
2. Thí nghiệm: Chuồng nuôi gà Ai Cập đang đẻ (500 con). Phun chế phẩm vi sinh vật với liều lượng 5 lít chế phẩm/100m2
sàn chuồng.
3. Thí nghiệm 1: Chuồng nuôi gà hậu bị (1000 con). Phun chế phẩm vi sinh vật với liều lượng 5 lít chế phẩm/100m2
sàn chuồng.
Các chuồng đặt thí nghiệm tại các trang trại nuôi gà ở xã Thanh Vân, huyện Tam Dương, tỉnh Vĩnh Phúc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chƣơng III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp
chất hữu cơ và sinh chất ức chế một số vi sinh vật gây bệnh
Từ bộ chủng vi sinh vật của phòng Vi sinh vật môi trường – Viện Công nghệ môi trường chúng tôi tiến hành chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải mạnh các hợp chất hữu cơ và một số chủng có khả năng sinh chất ức chế một số vi sinh vật gây bệnh.
Chúng tôi chọn chủng xạ khuẩn C3 có đặc điểm phân loại thuộc loài
Streptomyces thermoflavus là chủng có khả năng phân giải mạnh xenluloza [5].
Chọn các chủng vi khuẩn NB-4 có đặc điểm phân loại thuộc loài Bacillus cereus
và chủng vi khuẩn CHP-6 có đặc điểm phân loại giống loài Bacillus subtilis là các chủng có khả năng phân giải mạnh tinh bột và protein [16]. Chọn ba chủng vi khuẩn Lactic LB1, LB2, LB3 phân lập được từ mẫu nem chua Thanh Hóa để nghiên cứu, tuyển chọn chủng Lactobacillus có khả năng sinh chất ức chế một số vi sinh vật gây bệnh.
3.2. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng và sinh enzym của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Vi sinh vật là những cơ thể vô cùng nhỏ bé, sự thay đổi của các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, độ ẩm,… và các nguồn dinh dưỡng, muối khoáng đều ảnh hưởng tới sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzym của chúng. Do đó chúng tôi nghiên cứu một số yếu tố sau:
3.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym phân giải các hợp chất hữu cơ của các chủng vi sinh vật tuyển chọn, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng XK C3 trong các bình nón chứa môi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
trường Gause lỏng và 2 chủng vi khuẩn NB-4; CHP-6 trong các bình nón chứa môi trường MPB. Các chủng XK và VK được nuôi lắc 220 vòng/phút (72h đối với XK và 48h đối với các chủng VK) ở các thang nhiệt độ khác nhau (25o
C, 30oC, 37oC, 45oC, 50oC). Sau khi nuôi lắc lọc thu sinh khối XK sấy đến khối lượng không đổi để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng XK, dịch lọc enzym nhỏ trên lỗ thạch môi trường xenluloza để xác định ảnh hưởng cua nhiệt độ đến khả năng sinh enzym xenlulaza của chủng XK C3. Các chủng VK sau khi nuôi lắc đo mật độ VK trong dịch nuôi cấy (OD, λ = 560nm), lọc thu dịch lọc enzym rồi nhỏ dịch enzym thu được trên lỗ thạch môi trường tinh bột và môi trường cazein để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzym amylaza và proteaza của 2 chủng VK NB-4; CHP-6. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1; bảng 3.2 và hình 3.1; hình 3.2.
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trƣởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Chủng VSV
Nhiệt độ nuôi cấy
25oC 30oC 37oC 45oC 50oC
Sinh khối khô,
mg/ml C3 2,53 14,98 16,98 15,09 4,85 Mật độ vi sinh trong dịch nuôi cấy (OD) NB-4 0,63 1,38 0,95 0,15 0,05 CHP-6 0,6 1,57 0,93 0,23 0,15
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng sinh tổng hợp enzym của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
Môi trƣờng
Chủng VSV
Nhiệt độ nuôi cấy
25oC 30oC 37oC 45oC 50oC Đƣờng kín h v òng ph ân giải, mm Xenluloza C3 10 17 28 20 12 Tinh bột NB-4 8 26 21 11 5 CHP-6 10 27 23 16 12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Cazein NB-4 11 29 24 15 10 CHP-6 13 27 20 18 10 0 5 10 15 20 25 30 35
25oC 30oC 37oC 45oC 50oC
Nhiệt độ nuôi cấy
Đ ư ờn g k ín h v ò n g p h ân g iả i, m m Xenluloza (C3) Tinh bột (NB-4) Tinh bột (CHP-6) Cazein (NB-4) Cazein (CHP-6)
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh tổng hợp enzym của các